Untersuchungen zur Reaktion der Chalkonsynthase

Abstract

Die Diplomarbeit befasst sich mit der Expression und Reinigung des Enzyms Chalkonsynthase (CHS) und der Charakterisierung und Optimierung der von ihr katalysierten Bildung von Naringeninchalkon mit anschliessender Zyklisierung zum stabilen Naringenin durch Zugabe von Chalkonisomerase (CHI). Überdies wurde die Akzeptanz der CHS gegenüber einem weiteren Substrat, dem para-Dihydrocoumaroyl-CoA untersucht und auch dieses mit Malonyl-CoA zum Produkt – Phloretin – umgesetzt. Phloretin, ein Dihydrochalkon, ist ungewöhnlich hoch konzentriert im Apfel vorzufinden. Beide Reaktionen wurden charakterisiert und deren Kinetik miteinander verglichen.Ein CHS-Klon aus dem Kulturapfel (Malus domestica) war bereits in einem pGEX-Plasmid für die Expression in E. coli verfügbar, jedoch wurde trotz hoher Expressionsraten nur wenig aktives Enzym gewonnen. Die Variation von Expressionsparametern (IPTG Menge, Temperatur, Dauer) lieferte keine entscheidenden Verbesserungen. Die Transformation in den E. coli-Expressionsstamm BL21 könnte eine weitere Optimierung darstellen, jedoch wurde dieser Ansatz nicht weiterverfolgt, da der Wechsel des Plasmids von pGEX zu pTrc einen so gewaltigen Verbesserungsschritt darstellte, dass die Expression bereits zufriedenstellend war. Weitere Optimierungsschritte wie Induktormenge und Abkühlen der Kulturen vor der Induktion, sodass die Expression nicht startet, bevor die Kulturen die erforderten 28°C erreichen, lieferte hohe Mengen an aktivem Enzym, die für alle durchgeführten Untersuchungen ausreichte.Mit einer gereinigten Enzymlösung definierter Konzentration wurden die oben genannten, im pflanzlichen Organismus ablaufenden Reaktionen in-vitro durchgeführt und kinetische Parameter wie die Michaelis-Menten-Konstante KM sowie die maximale Reaktionsgeschwindigkeit Vmax in Bezug auf beide Reaktionsteilnehmer bei der Naringenin- bzw. Phloretinbiosynthese ermittelt. Der Vergleich der kinetischen Größen weist nicht darauf hin, dass die CHS aus dem Apfel spezielle Eigenschaften in Bezug auf die Phloretinsynthese besitzt. Die Sonderstellung, die der Apfel im Pflanzenreich aufgrund der großen gebildeten Phloretinmenge einnimmt, muss daher einen anderen Grund haben.

This thesis focuses on the expression and purification of the enzyme chalcone synthase (CHS) and the characterization of its reactions with two substrates. On the one hand, the formation of naringenin chalcone from p-coumaroyl-CoA and malonyl-CoA was studied, as part of the prominent flavonoid pathway, on the other hand, the formation of phloretin from p-dihydrocoumaroyl-CoA and malonyl-CoA, which is most prominent in apple. To the assays forming naringenin chalcone a second enzyme, chalcone isomerase (CHI) was added to promote the formation of the stable naringenin for detection purposes. Both reactions were compared to each other to gain insight into the rare ability of the apple to produce predominantly dihydrochalcones like phloretin and its derivatives.A CHS gene cloned into a pGEX plasmid from the cultivated apple (Malus domestica) was available in the research group. Although high expression rates could be obtained, most of the formed CHS was insoluble due to the formation of inclusion bodies and was therefore inactive. The variation of various expression parameters did not result in the production of active enzyme. Another CHS clone available in the research group, cloned into a pTrc plasmid provided better results. Large amounts of active enzyme were expressed, purified, and stored for later use in the enzyme assays.A series of enzyme assays were conducted, and the formed products quantified by HPLC. Kinetic parameters like the Michaelis-Menten-constant Km and the maximum reaction velocity Vmax for both cinnamoyl derivatives were determined and compared to each other. The results do not indicate that the apple CHS is the key enzyme responsible for the formation of large amounts of dihydrochalcones in its tissues. Even though the CHS prefers p-dihydrocoumaroyl-CoA as a substrate, Vmax was considerably lower. In the end, the catalytic efficiency kcat of both reactions are quite similar. The unusually high polyphenol content of apple tissues must therefore have other reasons.