Crystallization experiments with enzymes of the flavonoid metabolism

Abstract

Ein Isoenzym der Polyphenol Oxidase (PPO) aus der Gartenerdbeere (Fragaria x ananassa) konnte im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich als Fusionsprotein heterolog in Escherich Coli exprimiert werden, einerseits mit einem GST-Tag und andererseits mit einem His6-Tag. Die Aufreinigung des Proenzyms nach Abspaltung des His6-Tags erfolgte mittels Immobilisierten Metallionen Affinitätschromatographie (IMAC) und Anionenaustauschchromatographie (AEX). Dies führte zu einer Reinheit von mehr als 90 %), welche mit dynamischer Lichtstreuung (DLS) und Natriumdodecylsulfat Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) beurteilt wurde.Das Ziel der Arbeit war das Auffinden einer Kristallisationsbedingung, die Kristalle erzeugt die zur Strukturaufklärung mittels Röntgenkristallographie dienen. Dies sollte in weiter Folge zur in-silico Auffindung von potenziellen natürlichen Inhibitoren von Erdbeer-Polyphenol Oxidasen beitragen.Die Größe des Proteins wurde dabei mit SDS-PAGE auf 55 kDa geschätzt. Im Zuge von Aktivitätstests konnten zwei isosbestische Punkte identifiziert werden. Die isosbestischen Punkte 524 nm (ɛ524 = (1200 ± 277) M-1 cm-1) and 412 nm konnten für den Puffer 50 mM TRIS HCl, pH 7.75 (295.15 K) bei 298.15 K ermittelt werden. Die Tyrosinase-Aktivität der Polyphenol Oxidase konnte für die Substrate L-DOPA, Dopamin und Tyramine (16.3 U mg-1) in der Anwesenheit von SDS bestätigt werden. Das Proenzym zeigte Aktivität in der Abwesenheit von SDS, aber in der Gegenwart von den zweiwertigen Ionen Mg2+ and Ca2+, sowie nach dem Einsatz von Proteinase K.Stabilitätstests, der Einsatz von Methoden wie DLS, Thermofluor Assays und die Kupferquantifizierung führten alle zu dem Schluss, dass das Protein eine eingeschränkte Stabilität besitzt. Dies zeigte sich auch in den Kristallisationsversuchen, in denen erst nach unmittelbaren Einsatz nach Aufreinigung des Proteins eine potenzielle Bedingung identifiziert werden konnte. Nach 16 Tagen Inkubation konnte ein kristallines Objekt in 50 mM Natriumcitrat, 13 % (w/v) PEG 8000 bei pH 6.77 (at 22°C) gefunden werden, dass bei der Messung mittel Röntgenstrahlung verloren gegangen ist. Weitere Kristallistionsversuche führten zu keinen weiteren Kristallen im Rahmen dieser Arbeit.

Polyphenol oxidase (PPO) of the garden strawberry (Fragaria x ananassa), was successfully heterologously expressed as a fusion protein with GST-Tag or His6-Tag in Escherichia choli, respectively. The latter could be purified, after cleavage of the His6-tag, utilizing immobilized metal affinity chromatography (IMAC) and anion exchange chromatography (AEX) to a purity of more than 90 %. The purity was assessed with dynamic light scattering (DLS) and sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The goal of this thesis was the determination of a protein crystallization condition that leads to crystals that contribute to the protein structure determination with X-ray crystallography. Based on the protein structure an in-silico search of natural inhibitors of the enzyme, that decreases the shelf life of processed strawberry food significantly, should be performed.The molecular weight of the purified enzyme was estimated to be 55 kDa based on a clear single band in SDS-PAGE. Two isosbestic points were identified for the measurement of DOPAchrome at the wavelengths at 524 nm (ɛ524 = (1200 ± 277) M-1 cm-1) and 412 nm for the utilized buffer in the activity assays. The latent enzyme can be classified as tyrosinase, since it exhibited activity for the substrates tyramine with 16.3 U mg-1 and dopamine in the presence of SDS. The proenzyme was also activated in the absence of detergents utilizing serine proteinases and in the presence of Mg2+ and Ca2+ ions, unambiguously. The results of stability tests, which were based on SDS-PAGE, of thermal shift assays, copper quantifications and DLS confirmed that the enzyme ́s stability is limited. Therefore, an immediate execution of crystallization experiments after the purification of the latent PPO without a tag had led to a promising condition (50 mM sodium citrate, 13 % (w/v) PEG 8000, pH 6.77 (at 22°C)), that produced a crystalline object after 16 days. This very promising candidate was lost in the course of sample preparation for the X-ray crystallization. Further crystallization had not related to the growth of protein crystals and therefore, within the scope of this thesis the protein structure could not be allocated.