Bowstring-Stretching of Glycated Mouse Tail Collagen Fibrils

Abstract

Kollagen ist das häufigste Protein im menschlichen Körper und in allen Geweben anzutreffen, welche eine biomechanische Funktion erfüllen. Eine besonders interessante hierarchische Ebene sind die Kollagenfibrillen, die dem Gewebe Struktur verleihen und den Zellen ein Gerüst für die Interaktion zwischen Zellen und extrazellulärer Matrix und für diverse weitere Funktionen (z.B. Mechanotransduktion) bieten. Durch ihre besondere Struktur(lang und dünn, mit extremen Verhältnissen zwischen Länge und Durchmesser) widerstehen Kollagenfibrillen hauptsächlich Zugkräften. Durch das Alter oder durch verschiedene Krankheiten (z.B. Diabetes, Osteogenesis Imperfecta), können Aminosäuren mit Zuckern reagieren und intrafibrilläre nicht-enzymatische Addukte und Quervernetzungen bilden, die auch fortgeschrittene Glykierungsendprodukte genannt werden. Kollagenfibrillen aus Mäuseschwanzsehnen weisen nach der Bildung von nicht-enzymatischen Bindungen einen erhöhten Indentationsmodul auf. Weiters wurde bereits mit mikro-elektro-mechanischen Systemen gezeigt, das Kollagenfibrillen aus Rattenschwänzen eine erhöhte Zugfestigkeit durch nicht-enzymatische Quervernetzungen aufweisen. In dieser Studie wurden mittels eines Rasterkraftmikroskops (AFM) sowohl Nanoindentationsversuche als auch Zugversuche an denselben Fibrillensegmenten vor und nach einer Behandlung mit Methylglyoxal durchgeführt. Methylglyoxal führt zur Bildung von fortgeschrittenen Glykierungsendprodukten in Kollagenfibrillen. Die geometrische Anordnung des Zugversuchs entsprach dem Spannen einer Bogensehne und wurde in phosphatgepufferter Salzlösung durchgeführt. Außerdem wurde ein Nanoindentationsexperiment durchgeführt, welches topographische und zusätzliche mechanische Daten lieferte. Der mittlere maximale Tangentialmodul und der mittlere Sekantenmodul, welche aus den Spannungs-Dehnungs-Diagrammen abgeleitet wurden, zeigten eine statistisch signifikante Erhöhung nach der Glykierung an. In konkreten Werten erhöhte sich der maximale Tangentialmodul 1.45-fach (Etan,bef ore = 1302.8 ± 511.7 MPa, Etan,af ter = 1891.4 ± 540.0MPa, p=5.0∗10−6). Dieses Ergebnis wurde durch eine 1.40-fache Erh¨ohung des Sekan-tenmoduls best¨atigt (Esec,bef ore = 979.0 ± 448.0 MPa, Esec,af ter = 1365.9 ± 517.4 MPa,p=6.2∗10−4). Eine Kontrollgruppe, welche ohne Methylglyoxal bei derselben Temperaturinkubiert wurde, wies keine signifikante ¨Anderung in beiden Modulen auf.Im Unterschied zu fr¨uheren Studien, verringerte sich der Indentationsmodul signifikantnach der Glykierung (Eind,bef ore = 2.29 ± 1.18 MPa, Eind,af ter = 0.70 ± 0.33 MPa,p=4.0∗10−9). Diesen unerwarteten Effekt erkl¨aren wir mit einer m¨oglichen Besch¨adi-gung der Kollagenfibrillen im ersten Durchgang der Zugversuche, welche noch vor derGlykierung durchgef¨uhrt wurden. Außerdem wurden auch Einschnitte in den Kollagenfib-rillen, welche bei den Zugversuchen durch die AFM-Spitze verursacht wurden, gefunden.Darum vermuten wir, dass die Kollagenfibrillen durch die Zugversuche besch¨adigt wur-den, obwohl wir die Dehnung in der ersten Runde der Zugversuche (vor der Glykierung)auf maximal 12 % beschr¨ankt haben.Zusammengefasst wurde eine signifikante Steigerung der Zugfestigkeit gefunden. DieseSteigerung k¨onnte im Zuge dieser Studie durch die Besch¨adigung der Proben vielleichtsogar untersch¨atzt worden sein. Die Kombination aus einem verringerten Indentations-modul und einer erh¨ohten Zugfestigkeit bedarf weiterer Untersuchung.

Collagens are the most abundant proteins in the human body, and they are found inall tissues that have mechanical functionality. Of particular interest are collagen fibrils,which provide structural support to tissues and a framework in which cells interact andfunction. Because of their structure, long but thin with extreme aspect ratios, collagenfibrils withstand tensile forces. During time and/or disease (e.g. diabetes, osteogenesisimperfecta) collagen fibrils are susceptible to the reaction of amino acids with sugarsresulting in the formation of intrafibrillar non-enzymatic adducts and cross-links, also re-ferred to as advanced glycation endproducts (AGEs). Mouse tail tendon collagen fibrilsbecome stiffer in indentation after formation of non-enzymatic crosslinks. Furthermore,rat tail tendon collagen fibrils were shown to have increase in tensile modulus due to non-enzymatic cross-links by means of micro-electro-mechanical systems. In this study, bothnanoindentation experiments and tensile testing by means of an Atomic Force Microscope(AFM) on the very same collagen fibril segments before and after a glycation protocolwith methylglyoxal (MGO) were combined. MGO is known to introduce advanced gly-cation endproducts (AGEs) to collagen fibrils, altering their indentation stiffness. Thetensile testing was conducted in the bowstring stretching geometry on collagen fibrils hy-drated in phosphate buffered saline (PBS). Furthermore, a nanoindentation experimentwas performed in PBS before the tensile tests (before and after glycation), to providetopographical and additional mechanical data.The average peak tangent modulus and average secant modulus obtained from the stress-strain data increased significantly after glycation. In particular, the average peak tangentmodulus displayed a 1.45-fold increase (Etan,bef ore = 1302.8 ± 511.7 MPa, Etan,af ter =1891.4 ± 540.0 MPa, p=5.0∗10−6), while the secant modulus verified this result with a1.40-fold increase (Esec,bef ore = 979.0 ± 448.0 MPa, Esec,af ter = 1365.9 ± 517.4 MPa,p=6.2∗10−4). A control group subjected to the same incubation cycle without MGO didnot show a significant change in both peak tangent and secant modulus.While, contrary to the previous findings, the indentation modulus decreased significantlyafter glycation with MGO (Eind,bef ore = 2.29 ± 1.18 MPa, Eind,af ter = 0.70 ± 0.33 MPa,p=4.0∗10−9), we attribute this to potential damage occurring to the collagen fibrils duringbowstring stretching. Furthermore, notches introduced during the first round of tensiletesting were found after glycation, giving further evidence to this hypothesis. For thesereasons we hypothesize, that the collagen fibrils were damaged during bowstring stretch-ing, despite limiting strain to 12 % in the first experiment performed before incubation.To sum up, a significant tensile stiffening due to MGO glycation was demonstrated, butthe magnitude of this effect might even be underestimated by the data presented. Thecombination of increased tensile modulus and decreased indentation modulus warrantsfurther study.