Bowstring-stretching of glycated mouse tail collagen fibrils

Abstract

Collagens are the most abundant proteins in the human body, and they are found in all tissues that have mechanical functionality. Of particular interest are collagen fibrils,which provide structural support to tissues and a framework in which cells interact and function. Because of their structure, long but thin with extreme aspect ratios, collagen fibrils withstand tensile forces. During time and/or disease (e.g. diabetes, osteogenesis imperfecta) collagen fibrils are susceptible to the reaction of amino acids with sugars resulting in the formation of intrafibrillar non-enzymatic adducts and cross-links, also referred to as advanced glycation endproducts (AGEs). Mouse tail tendon collagen fibrils become stiffer in indentation after formation of non-enzymatic crosslinks. Furthermore, rat tail tendon collagen fibrils were shown to have increase in tensile modulus due to non-enzymatic cross-links by means of micro-electro-mechanical systems. In this study, both nanoindentation experiments and tensile testing by means of an Atomic Force Microscope(AFM) on the very same collagen fibril segments before and after a glycation protocol with methylglyoxal (MGO) were combined. MGO is known to introduce advanced glycation endproducts (AGEs) to collagen fibrils, altering their indentation stiffness. The tensile testing was conducted in the bowstring stretching geometry on collagen fibrils hydrated in phosphate buffered saline (PBS). Furthermore, a nanoindentation experiment was performed in PBS before the tensile tests (before and after glycation), to provide topographical and additional mechanical data.The average peak tangent modulus and average secant modulus obtained from the stress-strain data increased significantly after glycation. In particular, the average peak tangent modulus displayed a 1.45-fold increase (Etan,before = 1302.8 ± 511.7 MPa, Etan,after =1891.4 ± 540.0 MPa, p=5.0∗10−6), while the secant modulus verified this result with a1.40-fold increase (Esec,before = 979.0 ± 448.0 MPa, Esec,after = 1365.9 ± 517.4 MPa,p=6.2∗10−4). A control group subjected to the same incubation cycle without MGO did not show a significant change in both peak tangent and secant modulus. While, contrary to the previous findings, the indentation modulus decreased significantly after glycation with MGO (Eind,before = 2.29 ± 1.18 MPa, Eind,after = 0.70 ± 0.33 MPa,p=4.0∗10−9), we attribute this to potential damage occurring to the collagen fibrils during bowstring stretching. Furthermore, notches introduced during the first round of tensile testing were found after glycation, giving further evidence to this hypothesis. For these reasons we hypothesize, that the collagen fibrils were damaged during bowstring stretching, despite limiting strain to 12 % in the first experiment performed before incubation.To sum up, a significant tensile stiffening due to MGO glycation was demonstrated, but the magnitude of this effect might even be underestimated by the data presented. The combination of increased tensile modulus and decreased indentation modulus warrants further study.

Kollagen ist das häufigste Protein im menschlichen Körper und in allen Geweben anzutreffen, welche eine biomechanische Funktion erfüllen. Eine besonders interessante hierarchische Ebene sind die Kollagenfibrillen, die dem Gewebe Struktur verleihen und den Zellen ein Gerüst für die Interaktion zwischen Zellen und extrazellulärer Matrix und für diverse weitere Funktionen (z.B. Mechanotransduktion) bieten. Durch ihre besondere Struktur(lang und dünn, mit extremen Verhältnissen zwischen Länge und Durchmesser) widerstehen Kollagenfibrillen hauptsächlich Zugkräften. Durch das Alter oder durch verschiedene Krankheiten (z.B. Diabetes, Osteogenesis Imperfecta), können Aminosäuren mit Zuckern reagieren und intrafibrilläre nicht-enzymatische Addukte und Quervernetzungen bilden, die auch fortgeschrittene Glykierungsendprodukte genannt werden. Kollagenfibrillen aus Mäuseschwanzsehnen weisen nach der Bildung von nicht-enzymatischen Bindungen einen erhöhten Indentationsmodul auf. Weiters wurde bereits mit mikro-elektro-mechanischen Systemen gezeigt, das Kollagenfibrillen aus Rattenschwänzen eine erhöhte Zugfestigkeit durch nicht-enzymatische Quervernetzungen aufweisen. In dieser Studie wurden mittels eines Rasterkraftmikroskops (AFM) sowohl Nanoindentationsversuche als auch Zugversuche an denselben Fibrillensegmenten vor und nach einer Behandlung mit Methylglyoxal durchgeführt. Methylglyoxal führt zur Bildung von fortgeschrittenen Glykierungsendprodukten in Kollagenfibrillen. Die geometrische Anordnung des Zugversuchs entsprach dem Spannen einer Bogensehne und wurde in phosphatgepufferter Salzlösung durchgeführt. Außerdem wurde ein Nanoindentationsexperiment durchgeführt, welches topographische und zusätzliche mechanische Daten lieferte. Der mittlere maximale Tangentialmodul und der mittlere Sekantenmodul, welche aus den Spannungs-Dehnungs-Diagrammen abgeleitet wurden, zeigten eine statistisch signifikante Erhöhung nach der Glykierung an. In konkreten Werten erhöhte sich der maximale Tangentialmodul 1.45-fach (Etan,bef ore = 1302.8 ± 511.7 MPa, Etan,af ter = 1891.4 ± 540.0MPa, p=5.0∗10−6). Dieses Ergebnis wurde durch eine 1.40-fache Erhöhung des Sekantenmoduls bestätigt (Esec,bef ore = 979.0 ± 448.0 MPa, Esec,af ter = 1365.9 ± 517.4 MPa,p=6.2∗10−4). Eine Kontrollgruppe, welche ohne Methylglyoxal bei derselben Temperaturinkubiert wurde, wies keine signifikante Änderung in beiden Modulen auf. Im Unterschied zu früheren Studien, verringerte sich der Indentationsmodul signifikant nach der Glykierung (Eind,before = 2.29 ± 1.18 MPa, Eind,after = 0.70 ± 0.33 MPa,p=4.0∗10−9). Diesen unerwarteten Effekt erklären wir mit einer möglichen Beschädigung der Kollagenfibrillen im ersten Durchgang der Zugversuche, welche noch vor der Glykierung durchgeführt wurden. Außerdem wurden auch Einschnitte in den Kollagenfibrillen, welche bei den Zugversuchen durch die AFM-Spitze verursacht wurden, gefunden. Darum vermuten wir, dass die Kollagenfibrillen durch die Zugversuche beschädigt wurden, obwohl wir die Dehnung in der ersten Runde der Zugversuche (vor der Glykierung) auf maximal 12 % beschränkt haben. Zusammengefasst wurde eine signifikante Steigerung der Zugfestigkeit gefunden. DieseSteigerung könnte im Zuge dieser Studie durch die Beschädigung der Proben vielleicht sogar unterschätzt worden sein. Die Kombination aus einem verringerten Indentationsmodul und einer erhöhten Zugfestigkeit bedarf weiterer Untersuchung.