Assessment of peripheral nerve regeneration across a 7mm gap in the delayed rat median nerve model : a comparative study of autologous nerve graft, muscle filled-in vein conduit, and extracellular vesicle-based therapies

Abstract

Periphere Nervenverletzungen stellen nach wie vor eine große klinische Herausforderung dar und führen trotz chirurgischer Eingriffe häufig zu einer unvollständigen funktionellen Wiederherstellung. Zuverlässige präklinische Modelle sind für die Bewertung von Reparaturstrategien und das Verständnis der biologischen Prozesse, die bei der Nervenreparatur eine Rolle spielen, von entscheidender Bedeutung. Diese Studie untersucht Behandlungsmethoden zur Verbesserung der Regeneration des Nervus medianus nach segmentalen Verletzungen bei Ratten, wobei der Schwerpunkt auf der verzögerten Nervenreparatur liegt. In dieser Studie wird die autologe Nerventransplantation (ANT) mit muskelfüllten Venenkonduits (MVCs) nach einer 8-wöchigen Reparaturverzögerung verglichen, mit oder ohne zusätzliche Behandlung mit extrazellulären Vesikeln (EVs), entweder Wildtyp-EVs oder modifizierten EVs zur Verbesserung der Laminin-Bindungsfunktion. Insgesamt 48 männliche Lewis-Ratten (Durchschnittsgewicht: 484 g) wurden gleichmäßig auf sechs Conduit-Typen und Behandlungsgruppen verteilt (MVC = 24, ANT = 24, davon: PBS = 8, modEVs = 8 und wtEVs = 8). Zwölf Wochen nach der Reparatur wurde die Nervenregeneration durch in-vivo-elektrophysiologische Aufzeichnungen und histologische Analysen bewertet. Die zusammengesetzten Muskelaktionspotenziale (CMAPs) wurden hinsichtlich Latenz, Dauer, Amplitude und Fläche unter der Kurve analysiert. Die Werte wurden mit histologischen Daten (H&E-, c-Jun-, GFAP-, MSB- und MBP-Färbung) verglichen. Ein wichtiges Ziel dieser Studie war es, eine standardisierte Pipeline für die quantitative Histomorphometrie unter Verwendung der MBP-Immunfärbung in Kombination mit AxonDeepSeg, einem automatisierten Segmentierungswerkzeug, zu etablieren. Diese Plattform ermöglichte eine konsistente Quantifizierung der Axon- und Myelin Strukturen. Während die EV-Behandlungen keine statistisch signifikanten Verbesserungen ergaben, was vor allem auf die Variabilität zwischen den Tieren zurückzuführen war, zeigten die ANT-Gruppen überlegene Regenerationsergebnisse, was durch höhere CMAP-Amplituden und größere Flächen unter der Kurve im Vergleich zu den MVC-Gruppen belegt wurde. Wichtig ist, dass starke lineare Korrelationen zwischen der Gesamtzahl der Nervenfasern und der CMAP-Amplitude (p = 0,0002) sowie der Fläche unter der Kurve (p = 0,0005) beobachtet wurden. Weitere signifikante Korrelationen wurden zwischen der CMAP-Dauer und dem Axondurchmesser (p = 0,0014), der Myelindicke (p = 0,0241) und dem g-Verhältnis (p = 0,0011) festgestellt. Diese Ergebnisse unterstreichen die verbesserte Regenerationsfähigkeit von ANT gegenüber MVC bei verzögerten Reparaturprozessen und bestätigen die Verwendung der MBP-Färbung mit AxonDeepSeg als robuste Methode für die histomorphometrische Analyse in Studien zu peripheren Nerven.

Peripheral nerve injuries remain a major clinical challenge, often resulting in incomplete functional recovery despite surgical intervention. Reliable preclinical models are crucial for evaluating repair strategies and understanding the biological processes that play a role in nerve repair. This study investigates treatment modalities to enhance regeneration of the median nerve following segmental injury in rats, with a focus on delayed nerve repair. In this study the autologous nerve transplant (ANT) is compared to muscle filled-in vein conduit (MVCs) after an 8-week repair delay, with or without additional treatment using extracellular vesicles (EVs), either wild-type EVs or modified EVs to enhance laminin-binding functionality. A total of 48 male Lewis rats (mean weight: 484 g) were evenly distributed across six conduit type and treatment groups (MVC = 24, ANT= 24, of which: PBS= 8, modEVs= 8 and wtEVs= 8). Twelve weeks post-repair, nerve regeneration was assessed through in-vivo electrophysiological recordings and histological analyses. Compound muscle action potentials (CMAPs) were analyzed for latency, duration, amplitude, and area under the curve. The values were compared with histological data (H&E, c-Jun, GFAP, MSB, and MBP staining). A key objective of this study was to establish a standardized pipeline for quantitative histomorphometry using MBP immunostaining in combination with AxonDeepSeg, an automated segmentation tool. This platform enabled consistent quantification of axonal and myelin structures. While EV treatments did not yield statistically significant improvements, largely due to inter-animal variability, the ANT groups demonstrated superior regenerative outcomes, as evidence by higher CMAP amplitudes and larger areas under the curve compared to MVC groups. Importantly, strong linear correlations were observed between the total number of nerve fibers and CMAP amplitude (p = 0.0002) and area under the curve (p = 0.0005). Additional significant correlations were found between CMAP duration and axon diameter (p = 0.0014), myelin thickness (p = 0.0241), and g-ratio (p = 0.0011). These findings highlight the enhanced regenerative capacity of ANT over MVC in delayed repair scenarios and validate the use of MBP staining with AxonDeepSeg as a robust method for histomorphometric analysis in peripheral nerve studies.