Ionic liquids and their application in molecular diagnostics

Abstract

Die molekulare Diagnostik ermöglicht die schnelle und präzise Erkennung, Identifizierung und Charakterisierung mikrobieller und viraler Krankheitserreger. Trotz Fortschritten in den Analysetechniken schränken Herausforderungen wie hohe Kosten, komplexe Ausrüstung, Bedarf von qualifiziertem Personal und Probleme wie komplexe Nukleinsäureextraktion, Inhibition und Kontaminationen die breite Anwendung ein. Ionische Flüssigkeiten (ILs), geschmolzene organische Salze mit einzigartigen Eigenschaften, sind in der Lage Biopolymere zu lösen, Zellen zu lysieren und mit Nukleinsäuren und Proteinen zu interagieren, und bieten vielversprechende Lösungsansätze für oben genannte Herausforderungen. Diese Arbeit untersucht das Potenzial hydrophiler ionischer Flüssigkeiten, um Nukleinsäureextraktions- und Analysemethoden in der molekularen Diagnostik zu verbessern. Eine neuartige DNA- und RNA-Extraktionsmethode für Bakterien, die die ionische Flüssigkeit 1-Ethyl-3-methylimidazoliumacetat und siliziumbeschichtete magnetische Beads verwendet, wurde entwickelt. Die Methode, die IL-basierte Zelllyse bei Raumtemperatur mit Aufreinigung durch magnetische Beads kombiniert, zeigte Effizienzen, die mit kommerziellen Extraktionskits vergleichbar sind, und sparte dabei Aufwand, Zeit und Kosten. Die Methode wurde anschließend für den Nachweis bakterieller Erreger in Urinproben von Patienten mit Harnwegsinfektionen (HWI) angepasst. Der IL-basierte Ansatz ermöglichte eine zuverlässige Detektion mittels qPCR und 16S rRNA-Sequenzierung und bietet eine praktikable Alternative in der UTI-Diagnostik. Die Untersuchung der Lysefähigkeit verschiedener hydrophiler ILs für Pilzsporen und Myzel zeigte außerdem, dass sie schnellere, einfachere und sanftere Alternativen zu gängigen Lysemethoden sind. Zuletzt wiesen Experimente zu den Auswirkungen von ILs auf Nukleinsäuren und molekularen Assays auf ihr großes Potenzial als Enhancer von Nukleinsäureamplifikationsreaktionen hin.Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass hydrophile ILs ein großes Potenzial haben, das Feld der molekularen Diagnostik für den laborbasierten, on-site oder in-field Einsatz zu verbessern und voranzubringen. Sie bieten die Möglichkeit, Kosten zu senken, die Nukleinsäureextraktion zu vereinfachen und zu beschleunigen, Kontaminationen während der Probenverarbeitung zu verhindern, Inhibitionen entgegenzuwirken und Nukleinsäureanalysereaktionen zu verbessern. Die Integration von ILs in Arbeitsabläufe könnte das Feld der molekularen Diagnostik erheblich verbessern.

Molecular diagnostics allow for the rapid and accurate detection, identification, and characterization of microbial and viral pathogens. Despite advancements in analysis techniques, challenges such as high costs, complex equipment, skilled personnel requirements, and issues like complex nucleic acid extraction, inhibition, and contamination limit the widespread application. Ionic liquids (ILs), molten organic salts with unique properties can solubilize biopolymers, lyse cells, and interact with nucleic acids and proteins, offering promising solutions to these challenges. This work explores the potential of hydrophilic ILs to improve nucleic acid extraction and analysis methods in molecular diagnostics. A novel DNA and RNA extraction method for bacteria, using the IL 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate and silica-coated magnetic beads was developed. The method, which combines IL-based cell lysis at room temperature with magnetic bead purification, demonstrated efficiencies comparable to commercial kits, while saving effort, time and costs. Consequently, the method was adapted for bacterial pathogen detection in urine samples from patients with urinary tract infections (UTIs). The IL-based approach enabled reliable detection via qPCR and 16S rRNA sequencing, offering a viable alternative in UTI diagnostics. Investigating the lysis potential of various hydrophilic ILs for fungal spores and mycelia also revealed them as faster, simpler and gentler alternatives to common lysis methods. Lastly, research on the effects of ILs on nucleic acids and molecular assays indicated great potential as enhancers of nucleic acid amplification reactions.In summary, this thesis demonstrates that hydrophilic ILs have great potential to enhance and advance the field of molecular diagnostics for lab-based, on-site and in-field applications. They offer the prospect of lowering operational costs, simplifying and accelerating nucleic acid extraction, preventing contamination during sample processing, counteracting inhibition, and enhancing nucleic acid analysis reactions. The integration of ILs into workflows could improve the field of molecular diagnostics significantly.