Impact of chromatin remodeling on the expression of Xyr1 regulon genes in Trichoderma reesei

Abstract

Der Ascomycet Trichoderma reesei wird für die Produktion von Zellulasen und Hemizellulasen im industriellen Bereich verwendet. Die Expression der Gene, die diese Enzyme kodieren, wurde bisher hauptsächlich auf Ebene der Transkriptionsregulation durch regulierende Proteine erforscht, insbesondere die Transaktivatoren Xyrl (Xylanase Regulator 1) und der Repressor Cre1(Carbon Katabolit Repressor 1), deren Zusammenspiel hauptsächlich die Expression dieser Enzyme reguliert. Den Auswirkungen von Chromatin-Remodellierung, d.h. der dynamischen Modifikation der Chromatin-Architektur um den Zugang der regulatorischen Proteine an die genomische DNA zu ermöglichen, auf die Genexpression in T. reesei wurde bisher kaum Aufmerksamkeit geschenkt. Einer der wichtigsten Stämme vom T. reesei ist RUT-C30 ein hyperzellulolytischer Mutant, auf dem die meisten Stämme für die industrielle Herstellung von Enzymen, insbesondere Zellulasen, basieren. Ein wichtiges genetisches Merkmal von RUT-C30 ist eine teilweise Deletion des Gens cre1, durch die der Stamm partiell von Kohlenstoff Katabolit Repression (KKR) freigesetzt wird. Diese Deletion wird als Hauptgrund für den herausragenden Phänotyp dieses Stammes angesehen. Es ist jedoch noch unklar, was genau die Zellulaseproduktion in RUT-C30 verbessert. Diese Forschungsarbeit bringt neue Erkenntnisse über die Genexpression von Zellulasen und Hemizellulasen bezogen auf den Chromatin-Zugang von Cre1 und Xyr1. Sie erforscht weiters die Verkürzung von Cre1 in RUT-C30 als eine zusätzliche verstärkende Eigenschaft dieses Stammes, die über einfache Befreiung von KKR hinausgeht. Die hier vorgestellten Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Verkürzung von Cre1 zu Cre1-96 in Rut-C30 einen positiven regulatorischen Einfluss auf die Expression hat. Sie wirkt möglicherweise nicht nur in direkter Weise auf den Promotor von Zielgenen, sondern trägt durch die Regulierung eines Gens, das ein Protein zur Chromatin-Remodellierung kodiert, auch indirekt zu einem offeneren Chromatin-Status bei. Andererseits beeinflusst Xyr1 auch die Chromatin-Verpackung. Chromatin-Zugänglichkeit Echtzeit-PCR in Kombination mit Transkriptanalyse ergab, dass Xyr1 für die volle Induktion von Zellulase-kodierenden Genen durch Sophorose erforderlich ist und, dass höhere Genexpressionen mit Chromatin-Öffnung einhergehen. Darüber hinaus offenbart RNA-seq Analyse, dass Gen-Produkte, die an Histon-Acetylierung und ATP-abhängiger Chromatin-Remodellierung beteiligt sind, auch Chromatin Öffnung während Sophorose-Induktion beeinflussen. Schließlich wurde der Promotor von xyr1 auch als Ziel von Chromatin-Remodellierung enthüllt. Chromatin-Umlagerung erfolgt im xyr1 Promotor während der Induktion durch Sophorose. Diese Umlagerung erfolgt vor der Aktivierung von Zellulase Genexpression und die Zugänglichkeit des Promoters in einem Cre1-freien Hintergrund ist insgesamt höher, egal welche Kohlenstoffquelle vorhanden ist. Zusammenfassend ist die Regulierung der Genexpression von Zellulasen und Hemizellulasen in T. reesei nicht nur auf die Wirkung von Transkriptionsfaktoren beschränkt, sondern steht offensichtlich auch in Beziehung zu Änderungen in der Chromatin-Verpackung.

The ascomycete Trichoderma reesei is used for the production of plant cell wall-degrading enzymes (PCWDEs) in industrial scale. The expression of the PCWDE-encoding genes has been so far primarily investigated on the level of transcriptional regulation by regulatory proteins, especially the transactivator Xyr1 and the repressor Cre1. The interplay between these two transcription factors mainly regulates the expression of PCWDEs. Otherwise, the impact of chromatin remodeling, i.e. the dynamic modification of chromatin architecture to allow the regulatory proteins access to genomic DNA, on gene expression in T. reesei has received hardly any attention so far. One of the most important T. reesei strains, RUT-C30, is a hypercellulolytic mutant that became the ancestor of most industry strains used in the production of enzymes, in particular cellulases. One important genetic trait of RUT-C30 is a partial deletion of the gene cre1, which releases the strain from carbon catabolite repression (CCR). This deletion has been considered the main reason for the outstanding phenotype the strain presents. However, it is still unclear, what exactly enhances cellulase production in RUT-C30. This thesis presents new insights on the regulatory mechanism behind gene expression of PCWDEs, especially concerning the role of Cre1 and Xyr1 in chromatin access. It also explores the truncation of Cre1 in RUT-C30 as an additional enhancing characteristic of this strain that goes beyond just simple CCR release. The results presented here point towards the fact that the truncated form of Cre1 of RUT-C30, Cre1-96, exerts a positive regulatory influence on the expression. It possibly acts in a direct manner on the promoter of target genes, but also contributes indirectly to a more open chromatin status by regulating a gene encoding a possible chromatin-remodeling protein. On the other hand, Xyr1 also influences the chromatin packing. Chromatin accessibility real-time PCR combined with transcript analysis showed that Xyr1 is required for the full induction of cellulase-encoding genes by sophorose and that higher gene expression overlaps with chromatin opening. Additionally, RNA-seq analysis revealed that gene products involved in histone acetylation and ATP-dependent chromatin remodeling may also influence chromatin opening during sophorose induction. Finally, the promoter region of xyr1 was also identified as a target of chromatin remodeling. Chromatin rearrangement occurs in the xyr1 promoter during induction by sophorose and it takes place prior to activation of cellulase gene expression. Also, xyr1 promoter accessibility is overall higher in a cre1-truncated background, no matter which carbon source is present. To sum up, the regulation of PCWDEs gene expression in T. reesei is not only restricted to the action of transcription factors, but is clearly related to changes in the chromatin packaging.