Laser-based mid-infrared spectroscopy of aqueous protein solutions: From spectra to information through chemometrics

Abstract

Die Fourier-Transformations-Infrarot (FTIR)-Spektroskopie im mittleren Infrarotbereich ist eine etablierte Analysentechnik für markierungsfreie Technik für Struktur-Funktions-Studien von Proteinen. In diesem spektralen Bereich liefert vor allem die Amid-I-Bande eine Fülle von Informationen über die Sekundärstruktur von Proteinen, welche für die normale Aktivität und Funktion von Proteinen unerlässlich ist. Die Verwendung thermischer Lichtquellen in der FTIR-Spektroskopie schränkt jedoch die mit Messungen in Wasser kompatible Weglänge ein, da das Licht durch die Biegeschwingung des Wassers von 1640 cm−1 bis 1655 cm−1 fast vollständig absorbiert wird, was die Analyse der Amid-I-Bande erschwert. Folglich ist der Konzentrationsbereich, der untersucht werden kann, begrenzt. Die geringe Weglänge in der FTIR-Spektroskopie schränkt auch Durchflussmessungen und Denaturierungsstudien ein, da das Risiko einer Verstopfung der Messzellen erhöht ist. Als Lösung für das Problem der starken Wasserabsorption werden in dieser Arbeit Laser eingesetzt, um die Nachteile der FTIR-Spektroskopie zu überwinden, da sie eine fast 104 mal höhere Leistungsdichte als die traditionell verwendeten Lichtquellen bieten.Die hohe spektrale Leistungsdichte von Laserlichtquellen in der Infrarotspektroskopie verhindert die Abschwächung des Lichts unterhalb der Empfindlichkeitsschwelle des Detektors und ermöglicht so die Untersuchung von Proteinen in einer wässrigen Umgebung. Ein weiterer großer Vorteil dieser erhöhten spektralen Leistungsdichte ist die Möglichkeit, längere Weglängen zu verwenden, was eine effektivere Überwachung der Proteindenaturierung ermöglicht und kontinuierliche Durchflussmessungen unterstützt. Eine große Herausforderung bleibt jedoch bestehen: die intrinsische Komplexität der Amid-I-Bande, die die Interpretation der Messdaten erschwert.In dieser Arbeit wird anhand von drei verschiedenen Veröffentlichungen die Verwendung der Kombination aus laserbasierter Mid-IR-Spektroskopie und multivariater Kurvenauflösung – alternierende kleinste Quadrate (MCR-ALS) als Werkzeug zur Dekonvolution der komplexen Amid-I-Bande demonstriert. Die erste Veröffentlichung in dieser Arbeit veranschaulicht die Nützlichkeit von MCR-ALS bei der Suche nach Zwischenprodukten während der Proteindenaturierung durch seine Anwendung auf die thermische Denaturierung von Rinderserumalbumin (BSA). Diese Arbeit betont auch die Bedeutung der Wahl der Anzahl der Komponenten, die zur Erstellung von Modellen verwendet werden, und nutzt die aus MCR-ALS gewonnenen Fehlermatrizen, um das Ausmaß und die Konzentration der Informationen aufzuzeigen, die vom Modell nicht erklärt werden können, wenn eine geringere Anzahl von Komponenten als erforderlich gewählt wird. Darüber hinaus wird in dieser Arbeit ein praktischer Aspekt für Proteine berücksichtigt: ihre Lagerung und die Auswirkungen der Lagerung auf ihre Sekundärstruktur. Zu diesem Zweck wird die laserbasierte Mid-IR-Spektroskopie verwendet, um die Auswirkungen von vier Zuckern, Saccharose, Sucralose, Mannose und Trehalose, auf die Denaturierungstemperatur von Proteinen zu untersuchen. Das Ergebnis zeigt die überlegene Leistung von Trehalose in niedrigen Konzentrationen als Stabilisator und die destabilisierende Wirkung von Sucralose auf Proteine.In der zweiten Veröffentlichung, die in dieser Arbeit vorgestellt wird, wird die Rotationsmehrdeutigkeit von MCR-ALS bei der Verwendung als Werkzeug zur Untersuchung der Denaturierung untersucht. Die chemische Denaturierung von β-Lactoglobulin (BLG) durch Natriumdodecylsulfat (SDS) und die anschließende Renaturierung durch Octaethylenglykolmonododecylether (C12E8) wird als Modellsystem verwendet, um zu zeigen, wie komplexe Hintergründe zu mehreren mathematisch möglichen Lösungen in MCR-ALS führen können. Es wird eine Verbesserung in Form eines „verknüpften PLS” vorgestellt, die nicht nur die Komplexität der Hintergrundspektren berücksichtigt, sondern auch die Rotationsmehrdeutigkeit in MCR-ALS reduziert. Das verknüpfte PLS nutzt die gemeinsamen Spektralbereiche des Hintergrunds und der Proteinspektren, um den Hintergrundbeitrag in jedem Proteinspektrum zu schätzen, der anschließend von den Proteinspektren subtrahiert werden kann. Bei Verwendung als Vorverarbeitungsschritt vor MCR-ALS führt das verknüpfte PLS zu einer geringeren Rotationsmehrdeutigkeit bei der Untersuchung der Proteindenaturierung mit MCR-ALS. Schließlich wird eine Datenfusion zwischen den Spektren im mittleren Infrarotbereich und im Zirkulardichroismus (CD) der thermischen Denaturierung von α-Chymotrypsin (ACT) unter Verwendung von MCR-ALS demonstriert. Der Hauptvorteil dieser Art der Datenfusion besteht darin, dass sie die Grenzen der mit beiden Analysetechniken messbaren Konzentrationsbereiche überwindet. Zu diesem Zweck wird eine verbesserte Version von MCR-ALS verwendet, die einen Ein-Faktor-Ansatz zur Behandlung fehlender Daten im fusionierten Datensatz nutzt, wodurch Teile des Spektrums, die aufgrund von Konzentrationseffekten von Sättigung betroffen sind, aus der Analyse herausgenommen werden können. Der Vergleich der Ergebnisse der Datenfusion mit denen der Analyse der einzelnen Techniken hebt nicht nur die unterschiedliche Empfindlichkeit der beiden Techniken gegenüber verschiedenen Sekundärstrukturmotiven des Proteins hervor, sondern führt auch zur Entdeckung eines Zwischenprodukts während der thermischen Denaturierung von ACT.

Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy in the middle-infrared is a well-established analytical technique for structure-function studies in proteins. In this spectral range it is especially the amide I band that provides a plethora of information about the secondary structure of proteins, which is essential to the normal activity and function of proteins. However, the use of thermal light sources in FTIR spectroscopy limits the path length that is compatible with measurements in water to a few microns due to the near total absorption of light by the water bending mode between 1640 cm−1 to 1655 cm−1, which also overlaps with the amide I band. Consequently, the concentration range that can be studied is limited. The low path length in FTIR spectroscopy also constrains flow-through measurements and denaturation studies due the increased risk of cell clogging. As a solution, this work employs lasers to tackle the pitfalls of FTIR spectroscopy by offering an almost 104 higher power density than the traditionally used light sources.The high spectral power density of laser light sources for laser-based spectroscopy avoids the attenuation of light below the sensitivity of the detector also at longer path lengths (25 μm) thus experimentally enabling the study of proteins in the natural aqueous environment of normal water (H2O). This facilitates more effective monitoring of protein denaturation and supports continuous flow measurements. A great challenge yet remains - the inherently convoluted amide I band which complicates spectral interpretation.In this thesis, through the example of three different publications, the use of the combination of laser-based mid-IR spectroscopy with multivariate curve resolution – alternating least squares (MCR-ALS) as a tool to deal with the deconvolution of the complex amide I band is demonstrated. The first publication in this work exemplifies the utility of MCR-ALS in finding intermediates during protein denaturation through its application to the thermal denaturation of bovine serum albumin (BSA). This work also stresses on the importance of the choice of the number of components used to build models for MCR-ALS and uses the error matrices obtained from MCR-ALS to show the extent and concentration of information that remains unexplained by the model in case a lower number of components are chosen than required. Additionally, a practical aspect for proteins is considered in this work: their storage and the effect of storage on their secondary structure. To this end laser-based mid-IR spectroscopy is used to study the effect of four sugars, sucrose, sucralose, mannose and trehalose on protein denaturation temperature. The outcome shows the superior performance of low concentrations of trehalose as a stabilizer and the de-stabilizing effects of sucralose on proteins.In the second publication presented in this thesis, the rotational ambiguity of MCR-ALS when used as a tool to study denaturation is explored. The chemical denaturation of β-lactoglobulin (BLG) by sodium dodecyl sulfate (SDS) followed by its renaturation by octaethylene glycol mono-dodecyl ether (C12E8) is used as a model system to demonstrate how complex backgrounds can lead to multiple mathematically feasible solutions in MCR-ALS. An improvement to deal not only with the complexity of the background spectra but also reduce the rotational ambiguity in MCR-ALS in the form of a ‘linked-PLS’ is introduced. The linked PLS uses the shared spectral regions of the background and protein spectra to estimate the background contribution in each protein spectrum which can subsequently be subtracted from the protein spectra. When used as a pre-processing step before MCR-ALS, the linked PLS results in a lower rotational ambiguity while studying protein denaturation using MCR-ALS.Lastly, a data fusion between the mid-IR and circular dichroism (CD) spectra of the thermal denaturation of α-chymotrypsin (ACT) is demonstrated using MCR-ALS. The main benefit of this kind of data fusion is to observe the different transitions, vibrational and electronic, of the two techniques. To this end, an improved version of MCR-ALS that uses a single-factorization approach to deal with missing data arising from instrumental constraints concerning the accessible spectral regions at a given path length for both techniques is employed in the fused dataset. Comparing the results of the data fusion to those from analyzing the individual techniques, not only highlights the differential sensitivity of the two techniques to different secondary structure motifs of the protein but also results in the discovery of an intermediate during the thermal denaturation of ACT.