Characterization of A. woodii in continuous bioprocesses for enhanced C1 substrate bioconversion

Abstract

Die von Menschen verursachten Treibhausgasemissionen haben maßgeblich zum Klimawandel beigetragen und dafür gesorgt, dass das letzte Jahrzehnt das heißeste seit Aufzeichnungsbeginn war. Da CO2 der Hauptverursacher der globalen Erwärmung ist und dieses insbesondere bei der Herstellung von Werkstoffen im industriellen Sektor freigesetzt wird, muss die Notwendigkeit zur Entkarbonisierung hervorgehoben werden. Folglich würde der Einsatz von flüssigen, nachhaltig produzierten C1 Rohstoffen wie Formiat oder Methanol eine Minimierung der Treibhausgase ermöglichen. Während fest etablierte Organismen wie Escherichia coli oder Saccharomyces cerevisiae die Basis für viele industrielle Bioprozesse bilden, besteht bei acetogenen Organismen, die eine hervorragende Kohlenstoff- und Energieeffizient zur Konvertierung von C1 Rohstoffen über den Wood-Ljungdahl-Weg aufweisen, weiterhin der Bedarf einer vollständigen Charakterisierung im Hinblick auf die Physiologie und den Metabolismus, damit sie als nachhaltige Produktionsplattformen verwendet werden können. Um diese Wissenslücke schließen zu können, wird im Rahmen dieser Diplomarbeit der Acetogene Acetobacterium woodii auf sein Potential als Bioproduktionsplattform für die Formiat-Umsetzung in kontinuierlichen Fermentationen untersucht. Hierzu wurden drei Stämme in komplexen und chemisch definierten Medien (CDM) mit unterschiedlichen Substratkonzentrationen betrachtet: i) der Wildtyp DSM1030, AWO_WT, ii) ein adaptierter, auf CDM effizient wachsender Stamm AWO_CDM und iii) ein für Vitamin-Prototrophie veränderter Stamm AWO_vitamin_KI. Sowohl ihre physiologische Leistung als auch ihre zentralen metabolischen Werte wurden während der Fließgleichgewichte (Steady-states) des Chemostaten charakterisiert und mit zuvor publizierten Daten verglichen.Die Gegenüberstellung des Wachstums von AWO_WT auf Formiat im komplexen Medium zeigte eine sehr gute Übereinstimmung mit vorliegenden Daten, weshalb nachfolgend der erstellte Datensatz als Referenz für weitere A. woodii Stämme und Fermentationskonditionen verwendet wurde. Obwohl das Wachstum in einem Medium, welches Hefeextrakt beinhaltet, ohne Probleme eingestellt werden konnte, zeigte der Wechsel zu CDM, dass hier kein Wachstum möglich war.Der zweite Stamm, AWO_CDM, wies eine erfolgreiche Adaption an CDM auf. Während der Chemostat-Kultivierungen wurde dieser bei einer Verdünnungsrate von 0,05 h-1 auf seine metabolischen Fähigkeiten und Schlüsselperformanz-Parameter mittels dynamischer D-Stat-Fermentationen untersucht. Zusätzlich zeigten erste Tests hinsichtlich des Potentials zur Co-Verwertung von Formiat und Methanol, dass unter strikten N2-Bedingungen ein CO2-abhängiger Engpass herrscht. Produktkonzentrationen von AWO_WT und AWO_CDM lagen im selben Bereich und Acetat-Ausbeuten erreichten das theoretische Maximum von 0.25 Mol Acetat Mol-1 Formiat. Die spezifischen Raten von AWO_CDM wiesen Verbesserungen auf, wenn ihre Kultivierung in CDM stattfand. Es wurde eine spezifischen Formiat Aufnahmerate von 96 mmol g-1 h-1 bei einer Formiatkonzentration von 300 mM erreicht.Schlussendlich manifestierte die Analyse des AWO_vitamin_KI-Stammes dessen Unfähigkeit für Wachstum in komplexem oder chemisch definiertem Medium. Grund dafür war eine Mutation innerhalb eines zentralen genetischen Klusters, der für die Regulation der Methylentetrahydrofolat-Reduktase-Aktivität zuständig ist.Zusammenfassend ergeben die Resultate dieser Charakterisierung A. woodii’s, dass diesem ein hohes Potential als Biokatalysator für die Formiatumsetzung in Bioprozessen zuzuschreiben ist.

Human-made greenhouse gas emissions are the key driving force behind climate change and have led to the hottest decade on record. With CO2 being the most significant contributor to global warming and the industrial sector (e.g. material production) being the highest emitter due to its continued combustion of fossil fuels, the need for decarbonization is highlighted. Thus, harnessing sustainably produced and miscible one carbon (C1) feedstocks, such as formate and methanol, would allow a minimization of greenhouse gas emissions. However, while the usage of well-established organisms such as Escherichia coli or Saccharomyces cerevisiae has served as the foundation of many industrial bioprocesses, acetogens who achieve exceptional energy efficiency during metabolization of C1 substrates via the Wood-Ljungdahl pathway, have yet to be fully characterized concerning their physiology and metabolism in order to establish them as sustainable production hosts. To bridge this knowledge gap, this thesis investigates the acetogen Acetobacterium woodii and its potential as a bioproduction platform for formate utilization in steady state and dynamic continuous cultures. Three strains, (i) the wildtype strain DSM1030, AWO_WT, (ii) a strain adapted to grow efficiently in chemically defined medium (CDM), AWO_CDM, and (iii) a strain engineered for vitamin prototrophy, AWO_vitamin_KI) were tested in complex medium and CDM containing different substrate concentrations. Their physiological performance during steady-state conditions was characterized and key metabolic values were compared to previously published data.First, a comparison between AWO_WT grown on formate in complex medium showed good alignment with previously published data and will serve as a reference to which other A. woodii strains and conditions can be compared. While growth on media with yeast extract could be established without problems, a change to CDM showed its inability to grow without yeast extract.The second strain, AWO_CDM, displayed successful adaptation to CDM and was analysed extensively during chemostat cultivations at a dilution rate of 0.05 h-1 for its metabolic ability and key performance parameters by implementing dynamic dilution rate stat cultures (D-stats). Additionally, first tests concerning its potential for co-utilization of formate and methanol showed a CO2 dependent bottleneck under strictly N2 conditions.Product concentrations of both AWO_WT and AWO_CDM were in the same range and acetate yields reached the theoretical maximum of 0.25 mol acetate mol-1 formate. Furthermore, specific rates showed improvement, when cultivations were performed in CDM, leading to a specific formate uptake rate of 96 mmol g-1 h-1 when cultivated with a formate concentration of 300 mM. Finally, the investigation of strain AWO_vitamin_KI revealed the strains inability to be grown in complex or chemically defined medium due to a mutation of a key genetic cluster responsible for the regulation of the methylenate-THF reductase activity. Overall, the results of this characterization emphasize A. woodii’s high potential as a biocatalyst for formate utilization in bioprocesses.