Advances in bioprocess monitoring by mid-infrared spectroscopy

Abstract

Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein neues Messverfahren zur selektiven Aufnahme von Spektren von biologischen Zellen in Suspension im mittleren Infrarot (MIR) entwickelt. MIR Messungen mittels abgeschwächter Totalreflexion (ATR) wurden dazu mit Ultraschall-Partikel-Manipulation kombiniert. Ein Ultraschall-Aufsatz wurde entworfen, ein Prototyp gefertigt und mit einer speziell angefertigten ATR Sonde kombiniert. Mit dieser ultraschallgestützten ATR Sonde konnten Spektren von Saccharomyces cerevisiae in Suspension erfolgreich off-line aufgenommen werden. Mit den gewonnen Erkenntnissen wurde ein weiterer Prototyp entworfen und gefertigt, der zum Einsatz in situ in einem Bioreaktor geeignet war. Dieser wurde mit einem kommerziellen Prozessspektrometer kombiniert welches mit einer faser-optischen in-line ATR Sonde ausgestattet war. Mit diesem Aufbau konnten, nach bestem Wissen der Autorin, zum ersten Mal Spektren von Zellen in einem gerührten, begasten Bioreaktor aufgenommen werden. Die Änderung der Polysaccharidzusammensetzung von S. cerevisiae konnte off-line quantifiziert werden. Durch eine gezielt herbeigeführte Stickstoff-Limitation akkummulierten die Zellen Trehalose und Glykogen. MIR Spektren von gewaschenen, getrockneten Zell-Proben wurden mit einem Infrarotmikroskop aufgenommen, diese konnten mittels Partial Least Squares Regression (PLS-R) auf Referenzwerte aus nasschemischen Verfahren und High Pressure Liquid Chromatography kalibriert werden (root-mean-square Kreuzvalidierungsfehler: 0.33 % Trockengewicht (%DW) für Trehalose, 0.55 %DW für Glykogen und 1.17 %DW für Mannan). Mit der neu-entwickelten ultraschallgestützten faser-optischen ATR Sonde und Hauptkomponentenanalyse konnten ähnliche Änderungen in den Spektren der Zellen in der Fermentationsbrühe in-line verfolgt werden. Durch die simultane Änderung der Biomassekonzentration und des Polysaccharidgehalts der Zellen war eine quantitative Bestimmung der Analyten aus in-line Spektren nicht möglich. Darüber hinaus wurde die Eignung von Stand-der-Technik-MIR-Instrumentierung für die in-line Quantifizierung von im Medium gelösten Stoffen untersucht. Am Beispiel von Penicillium chrysogenum Fermentationen wurden PLS-R und multivariate curve resolution - alternating least squares (MCR-ALS) für die quantitative Bestimmung von Phenoxyessigsäure und Penicillin V verwendet. Die beiden Methoden ergaben vergleichbare Kalibrationsmodelle mit Detektionsschwellen im niedrigen g L-1 Bereich. Für MCR-ALS Modelle benötigt man mehr Wissen über den Prozess als für PLS-R, die Selektivität der MCR-ALS Modelle kann jedoch durch den Vergleich der errechneten 'pure component' Spektren mit gemessen Referenzspektren leichter überprüft werden. Im gleichen biologischen System wurden eine faser-optische und eine Sonde mit einem optischen Conduit simultan verwendet um Spektren in-line aufzunehmen. Die PLS-R Modelle für die beiden oben erwähnten Analyten waren von vergleichbarer Qualität, die Conduit-Sonde wies jedoch eine höhere Stabilität (Spektrum-zu-Spektrum-Änderungen) und ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis auf.

In this thesis two techniques, attenuated total reflection (ATR) mid-infrared (mid-IR) spectroscopy and ultrasonic particle manipulation, were successfully combined for the acquisition of mid-IR spectra of cells in suspension. A prototype ultrasound accessory was designed, realized and combined with a custom fiber optic ATR probe. The working principle was successfully tested off-line with suspensions of Saccharomyces cerevisiae. A second prototype fit for use in a semi-industrial bioprocess environment was designed and built. It comprised the optimized ultrasound accessory and a commercial process spectrometer equipped with an in-line fiber optic ATR probe. Using this instrumental development, to the best of the author-s knowledge, mid-IR spectra of cells inside a stirred, aerated bioreactor could be successfully recorded for the first time. Changes of the carbohydrate content of S. cerevisiae undergoing nitrogen-limited growth, i.e. the accumulation of trehalose and glycogen, could be followed quantitatively off-line. Mid-IR spectra of washed, dried cells were recorded and analyzed by partial least squares regression (PLS-R) with reference values obtained by wet chemistry and liquid chromatography (root-mean-square error of cross validation: 0.33 % dry weight (%DW) for trehalose, 0.55 %DW for glycogen, and 1.17 %DW for mannan). Similar spectral changes could also be observed in-line using the novel ultrasound enhanced fiber optic ATR probe and principal components analysis of spectra of cells present in the fermentation broth. Quantification of the analytes proved to be difficult because changes in biomass and in the carbohydrate content occurred simultaneously, and this correlation could not be broken. Complimentary, the applicability of state-of-the-art mid-IR technology for quantitative analysis of solutes in-line was explored. On the example of Penicillium chrysogenum fermentations, PLS-R and multivariate curve resolution-alternating least squares (MCR-ALS) were applied for the simultaneous determination of penicillin V and phenoxyacetic acid. The obtained results show that models are of comparable quality with LODs in the low gL-1 range. MCR-ALS requires more process knowledge than PLS-R, but provides an objective assessment for model validity by comparison of the calculated pure component with the respective reference spectra. Using the same biological system, a fiber optic and a conduit ATR probe were simultaneously applied in-line. No significant difference in performance for quantification of the two analytes by PLS-R could be found. However, higher spectrum-to-spectrum stability and better signal-to-noise were found for the optical conduit set-up.