Title: Hyperspectral imaging of hyphae and spores of penicillium chrysogenum using confocal Raman (micro)-spectroscopy
Language: English
Authors: Wieland, Karin 
Keywords: Analytische Chemie; Raman Spektroskopie; Analytical Chemistry; Raman spectroscopy
Advisor: Lendl, Bernhard  
Assisting Advisor: Koch, Cosima 
Issue Date: 2014
Number of Pages: 136
Qualification level: Diploma
Abstract: 
In dieser Arbeit wurden geeignete Messparameter zur Erforschung von Hyphen und Sporen von Penicillium chrysogenum mittels konfokaler Raman (Mikro-) Spektroskopie ermittelt. Des Weiteren galt es geeignete Fluoreszenzfarbstoffe zur Unterscheidung lebender und toter Bereiche in den Hyphen hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit in Kombination mit Raman Spektroskopie zu untersuchen, um ein bildgebendes Analysenverfahren basierend auf Raman und Fluoreszenzspektroskopie zu entwickeln. Damit Raman Spektroskopie eine zerstörungsfreie Methode bleibt, wurden die Hyphenproben mit maximal 50 % der Laserleistung des 532 nm Raman Lasers (<52 mW) analysiert, da eine höhere Leistung die biologische Probe aufgrund der thermischen Belastung zerstören würde. Der Großteil der Messungen wurde unter Verwendung eines 100x Objektivs durchgeführt, um möglichst viel an Detailinformation von den Proben zu erhalten. Es wurden Raman Bilder mit einer Größe von bis zu 105x124 microm2 aufgenommen, wobei jedes der insgesamt 13020 Pixel, aus denen das Bild aufgebaut ist, molekülspezifische Information enthält. Zur Datenanalyse wurden chemometrische Verfahren wie die Hauptkomponentenanalyse oder die hierarchische Clusteranalyse verwendet. Mithilfe dieser Algorithmen konnten Unterschiede im chemischen Aufbau der Probe wie beispielsweise ein erhöhter Gehalt an Phenylalanin, Protein (Amid I-, Amid III- Bande) und Nukleinsäuren im Cytoplasma basierend auf den spektroskopischen Daten nachgewiesen werden. Drei lebend/tot- Farbstoffe (DAPI, PI und FDA) wurden im Zuge dieser Arbeit hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit in Kombination mit Raman Spektroskopie untersucht, um floureszenzspektroskopische Aufnahmen desselben Probenbereichs als Referenz für die Raman Bilder zu ermöglichen. Da jedoch nur jene Farbstoffe verwendbar sind, die keine Absorption im Bereich der Raman Anregungswellenlänge zeigen, wird das Auffinden von geeigneten Farbstoffen bei Verwendung von mehr als einem Farbstoff zunehmend zu einer Herausforderung. Ein idealer Analysenablauf besteht darin, dass zuerst die Probe mit den Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt wird, bevor es zur Analyse mittels Raman kommt und anschließend ein Fluoreszenzbild aufgenommen wird. DAPI scheint dabei besonders vielversprechend im Bezug auf die Kombinierbarkeit mit Raman Spektroskopie unter Verwendung eines 532 nm Lasers, zeigte allerdings nur geringe Selektivität beim Färbeprozess. PI wurde zum Anfärben von toten Hyphenbereichen verwendet. Die Anregungswellenlänge des eingesetzten Raman Lasers liegt allerdings genau in der Absorptionsbande des Farbstoffs. Um lebende Bereich in den Hyphen anzufärben, wurde FDA verwendet, welches einigermaßen vielversprechende Ergebnisse zur Anwendung in Kombination mit Raman Spektroskopie lieferte. Die spektroskopische Untersuchung von Sporen von P. chrysogenum erwies sich als sehr komplex, da diese Proben nicht nur intensive Autofluoreszenz zeigen, sondern auch extrem thermolabil sind. Um die Limitierung in der einstellbaren Laserleistung zu umgehen, wurden Sporenspektren mithilfe von SERS (Surface enhanced Raman Scattering) gemessen, wobei Nanopartikel aus Silber basierend auf der Leopold-Lendl Methode synthetisiert wurden. Ein weiterer Ansatz bestand darin, den Raman Laser, welcher im sichtbaren Bereich emittiert, durch eine NIR Lichtquelle zu ersetzen. Damit gelang es, sowohl einzelne Ramanspektren als auch Mappings von Sporen mit einem 785 nm Raman Laser aufzunehmen. Zusätzlich wurde eine lebend/tot Studie durchgeführt, welche soweit vielversprechende Ergebnisse in der Unterscheidung zwischen lebenden und toten Sporen mittels Hauptkomponentenanalyse lieferte.

In this thesis, appropriate device settings for the investigation of hyphae and spores of Penicillium chrysogenum using confocal Raman microspectroscopy were determined. Furthermore, the application of appropriate fluorescent dyes for life/dead staining as reference method was investigated in the context of a combined use of imaging by Raman and fluorescence spectroscopy. For studying hyphal samples not more than 50 % of the maximum laser power of a 532 nm Raman laser (<52 mW) was applied under the condition that Raman spectroscopy remained a destruction-free method. Application of higher laser power increased the risk of sample destruction due to the thermal impact of the Raman laser. The majority of the measurements were performed with a 100x objective to cover as much detail of the sample as possible. Raman images up to a size of 105x124 microm2 were recorded where each of the 13020 pixels of the image contained molecule specific information concerning the sample under investigation. Chemometric algorithms such as principal component analysis (PCA) and hierarchical cluster analysis (HCA) were used for data analysis. Based on these investigations differences in the chemical composition of the sample were identified such as an increased intensity of Raman bands characteristic for phenylalanine, proteins (amide I, amide III) and nucleic acids in the cytoplasm. In this work, three different dyes (DAPI, PI and FDA) were investigated for life/dead staining. However, using fluorescent dyes as reference method got difficult once more than one fluorescent dye was used. Raman spectra of stained fungi could only be recorded as long as the excitation wavelength of the Raman laser is not within the absorption band of the fluorescent dye. In this specific work, bleaching was not a suitable option considering the desired work flow. An ideal procedure would consist of staining the sample, followed by subsequent investigation with Raman spectroscopy and as a third step a fluorescence image should be generated. Although DAPI would not interfere with the Raman spectrum, it turned out to be not very selective. PI used for dead cell staining was not compatible with Raman spectroscopy due to intense fluorescence at 532 nm excitation. FDA was used as life cell stain and showed most promising results in combination with Raman spectroscopy. Spectroscopic investigation of spores of P. chrysogenum was more complex due to autoflourescence and extreme thermolability. Thus, alternative investigation methods such as SERS (surface enhanced Raman scattering) where silver nanoparticles (Leopold-Lendl method) were employed to enhance the Raman signal were applied. Another approach consisted of replacing the visible Raman laser (532 nm) by a NIR laser source (785 nm). SERS spectra of spores as well as a mapping of a single spore were performed. Furthermore, a dead/alive study was performed using the NIR laser. In this study promising results for the differentiation between living and dead spores based on PCA were obtained.
URI: https://resolver.obvsg.at/urn:nbn:at:at-ubtuw:1-73919
http://hdl.handle.net/20.500.12708/3081
Library ID: AC12163296
Organisation: E164 - Institut für Chemische Technologien und Analytik 
Publication Type: Thesis
Hochschulschrift
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