Optimierung und Evaluierung eines Loop-mediated Isothermal Amplification Assays zum Nachweis des Lebensmittelallergens Sellerie

Abstract

Lebensmittelallergien sind weitverbreitet und stellen für die Betroffenen ein großes Gesundheitsrisiko dar. Aus diesem Grund hat die Europäische Union Gesetze zur Kennzeichnungspflicht allergener Inhaltsstoffe erlassen, die sowohl verpackte als auch unverpackte Lebensmittel betreffen. Es sind bereits zahlreiche auf Antikörper bzw. auf DNA basierende Assays zum Nachweis der wichtigsten Lebensmittelallergene erhältlich, aber um auf eine schnelle und vor Ort durchführbare Methode zurückgreifen zu können, wurde ein bereits entwickelter Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay zum Nachweis von Apium graveolens in Lebensmitteln und prozessierten Produkten optimiert und evaluiert. Dieser Assay stellte sich als hochspezifisch für Sellerie heraus - mit einem Detektionslimit von 7,8 mg Selleriepulver pro Kilogramm gespiketer Lebensmittelprobe. Die Analyse von zehn kommerziell erhältlichen Lebensmittelprodukten und die Bestimmung einer Falsch-Negativ-Rate für extrahierte DNA aus drei verschiedenen Lebensmittelmatrizes, die mit DNA aus Sellerie gespiket wurde, erlaubten einen Vergleich des LAMP-Assays mit dem ausgewählten Referenz-PCR-Assay. Die LAMP-Reaktion wurde auch auf Heizblöcken durchgeführt, um den verlässlichen Nachweis des Analyten unabhängig vom verwendeten Gerät zu demonstrieren. Weiters wurden die Amplifikationsprodukte mittels Agarose-Gelelektrophorese und Fluoreszenzfärbung visualisiert, um die Ergebnisse mit jenen zu vergleichen, die durch das Echtzeit-Fluoreszenz-Monitoring produziert wurden. Diese Resultate zeigen, dass der LAMP-Assay zum Nachweis von Sellerie hochspezifisch sowie einfach und vor Ort durchführbar ist und dass er in Kombination mit einer einfachen Visualisierungsmethode das Potential hat, zu einem vielversprechenden Analyseinstrument für kommerzielle Anwendungen zu werden.

Food allergies are widely distributed and pose a major health risk to affected people, which is why the European Union introduced labelling directives for packaged and unpackaged foods with regard to allergenic ingredients. There are already many immuno-based and DNA-based assays for the detection of the most important food allergens available, but in order to provide a rapid and onsite applicable method, an existing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the detection of Apium graveolens in foods and products thereof was optimized and evaluated. The assay was shown to be highly specific for celery, and the limit of detection (LOD) was found to be as low as 7.8 mg celery powder per kilogram spiked food sample. The analysis of ten commercially available food products and a determination of the false-negative rate for the DNA extracted from three food matrices spiked with celery DNA allowed a comparison of the LAMP assay to the selected reference real-time PCR assay. The LAMP reaction was also performed on different heating blocks to demonstrate a reliable detection of the analyte independent from the instrument used. Furthermore, the amplification products were visualized via agarose gel electrophoresis and fluorescence staining in order to compare the results to those obtained from real-time fluorescence monitoring. These outcomes show that the LAMP assay for the detection of celery is highly specific, easy-to-perform and on-site applicable, and in combination with a simple visualization technique, it has the potential to become a promising tool for commercial uses.