Development of DNA-based techniques for the rapid analysis of trichothecene and fumonisin producing Fusarium species and aflatoxins in maize

Abstract

The overall objective of this thesis was the development of DNA-based techniques for the rapid analysis of Fusarium species and aflatoxins in maize. The focus was laid on the mycotoxin classes trichothecenes and fumonisins as the most important mycotoxins produced by Fusarium sp. as well as aflatoxin B1, produced mainly by Aspergillus sp., which is considered to be the most potent natural carcinogen known. Although tests for such analytes are available, many of these methods are time-consuming, cost-intensive and difficult to transfer into a more field-applicable approach. The first part of the thesis addresses the development of a multiplex real-time PCR to quantify Fusarium DNA of trichothecene and fumonisin producing strains in maize. The plant pathogenic fungus Fusarium causes considerable economic impact worldwide. The kernel size and weight are usually reduced but even more important are the numerous toxic metabolites produced by these fungi during the colonization of the plant. These mycotoxins have been related to toxic effects upon ingestion by humans and animals. Mycotoxin concentrations in infected plants can vary significantly between maize cultivars and are usually higher in susceptible plants than in more resistant cultivars. Hence, the determination of the resistance of new maize varieties is of high importance and usually combines anaylsis of mycotoxins by enzyme linked immunosorbant assay (ELISA), high performance liquid chromatography (HPLC) coupled either to ultra-violet (UV) and/or mass spectrometry (MS) detection methods and the visual scoring of disease symptoms. However, these methods are time-consuming, cost-intensive (especially HPLC-MS) and only indirect, because they provide no information about the biomass of a fungus in the sample. A new method to gain direct information about the DNA biomass of a fungus is the quantitative polymerase chain reaction (qPCR) technique, which is based on the quantification of the amount of organism specific DNA. Hence, an infection can be detected before any symptoms are visible. Besides the evaluation of the resistance of varieties, qPCR can be applied for Fusarium monitoring projects and as a screening method for food and feed contamination. In this study a sensitive quantification method for trichothecene and fumonisin producing Fusarium species in maize has been developed. This method enables the high-throughput screening of a large number of samples for Fusarium infection in relatively short time due to simultaneous quantification of the mycotoxin-related genes tri5 (encoding for the fungal trichodiene synthase) and fum1 (encoding for a polyketide synthase), responsible for the production of trichothecenes and fumonisins, respectively. The newly developed multiplex method was applied to 24 maize field samples collected in Austria. Results obtained with the triplex assay were compared to the three singleplex qPCR runs to ensure that no loss of sensitivity occurs by using the simplified multiplex method. The new assay was found to be specific for either fumonisin or trichothecene producing Fusarium species. A limit of quantification (LOQ) of 0.32 pg DNA/µl for both Fusarium strains was found. Considering a genome size of 41.7 Mb for the fumonisin producing Fusarium strain F. verticillioides and a genome size of 36.2 Mb for the trichothecene producing Fusarium strain F. graminearium this represents approximately seven or eight genome equivalents, respectively. All samples were further analyzed for the trichothecenes deoxynivalenol (DON), DON-3-glucoside (D3G), nivalenol (NIV), 3-acetyl-DON (3-ADON), T-2 toxin, HT-2 toxin, diacetoxyscirpenol (DAS), and neosolaniol (NEO) and the fumonisins fumonisin B1 (FB1), fumonisin B2 (FB2), and fumonisin B3 (FB3) by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and compared with the qPCR results. This assay is the first report of the use of a multiplex qPCR for the quantification of trichothecene and fumonisin producing Fusarium species and was published in Analytical Methods (Appendix publication #1). Aflatoxins represent another important class of mycotoxins. They are mainly produced by the fungal strains Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus. Aflatoxin B1 (AFB1) is the most prevalent and potent one in the class of aflatoxins. It possesses high toxicity and was classified as carcinogenic to humans by the International Agency for Research on Cancer (IARC). Regulatory limits have been introduced for food and feed safety reasons in many countries and range from 1 µg/kg to 20 µg/kg. Therefore, rapid, sensitive and inexpensive analytical techniques are essential to detect and quantify AFB1. Procedures based on chromatographic methods combined with MS and rapid screening approaches with immunoassays have been developed. However, these methods show some major drawbacks such as the requirement of skilled personnel, expensive equipment and sample pre-treatment, and the use of antibodies. Due to the limitations of antibodies used in immunoassays such as thermal instability, laborious and expensive production, aptamer-based analytical methods have been developed offering a promising alternative to antibodies. Aptamers with high affinity to AFB1 have been developed in part two of this study. They have been selected using an iterative selection procedure named Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) for their ability to bind to AFB1 with high affinity and specificity. Sequences were obtained after four rounds of in vitro selection and were furthermore screened for their ability to bind AFB1. Five unique sequences were obtained and additionally characterized. The dissociation constant for each aptamer was determined by a fluorescence binding assay and was found to be 1.30 µM ± 0.14 µM for aptamer 1 (named Lib5_1e), 5.70 µM ± 0.54 µM for aptamer 2 (named Lib5_6e), 2.34 µM ± 0.13 µM for aptamer 3 (named Lib5_7e), 2.56 µM ± 0.13 µM for aptamer 4 (named Lib5_9e), and 4.95 µM ± 0.95 µM for aptamer 5 (named Lib5_10e). For AFB1 biosensor development approaches a DNA fragment designed by Neoventures Biotechnology Inc. (Canada) in 2009 was used. Until now, a few aptasensors, based on this aptamer, for the rapid detection of AFB1 have been developed. These assays are currently based on an indirect target detection format where a signal is produced if no target is present and vice versa. This study reports a new direct detection format for the target molecule AFB1 with a nucleic acid lateral flow test strip. The idea claims AFB1 induced unwinding of the aptamer-s distinctive structure exposing a binding site for a complementary signaling DNA probe enabling the hybridization of the probe with the aptamer. Different incubation temperatures responsible for hybridization/dehybridization have been evaluated (room temperature, 37 °C, and 40 °C). The test results revealed that a temperature of 37 °C worked best. The developed aptasensor model demonstrates the potential of the structure switching ability of aptamers in terms of direct target detection. To the best of our knowledge, a dipstick assay based on an aptamer enabling an AFB1 direct detection format has not yet been reported. A manuscript has been submitted to the journal Analytical Methods (Appendix publication #2). In conclusion, within this thesis a multiplex qPCR method for the rapid screening of maize samples for all Fusarium species producing the most prevalent mycotoxins in maize, trichothecenes and fumonisins, have been developed. Furthermore, a rapid and simple aptamer dipstick assay using a direct detection format for AFB1 has been designed. However, further optimization to increase the sensitivity and to speed-up the testing procedure is required.

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung DNA-basierender Techniken für die rasche Analyse von Pilzen der Gattung Fusarium sowie Aflatoxin in Mais. Der Fokus wurde einerseits auf die wichtigsten Toxingruppen die von Fusarium Arten produziert werden gelegt. Dies umfasst Trichothecene und Fumonisine. Ein weiteres Kerngebiet dieser Arbeit umfasst die rasche Detektion des Mykotoxins Aflatoxin B1, welches hauptsächlich durch Aspergillus Arten produziert wird und das stärkste, natürlich vorkommende Kanzerogen darstellt. Obwohl durchaus Testsysteme für diese Analyten existieren, sind viele der dabei angewandten Methoden zeitintensiv, kostspielig und lassen sich kaum als vor-Ort-Analysen einsetzten. Das erste Kapitel behandelt die Entwicklung einer multiplex real-time PCR Methode zur Quantifizierung von Fusarium DNA Trichothecen und Fumonisin produzierender Arten in Mais. Der pflanzenpathogene Pilz Fusarium führt weltweit zu erheblichen wirtschaftlichen Einbußen. Die Korngröße sowie das Gewicht werden bei Befall reduziert, jedoch weitaus problematischer ist die mögliche Produktion einer Vielzahl toxischer, sekundärer Metaboliten. Diese Mykotoxine stehen in Verbindung mit Vergiftungserscheinungen bei Aufnahme durch Mensch und Tier. Der Mykotoxingehalt befallener Maissorten kann erheblich schwanken und ist in empfindlichen Sorten generell höher als in Pflanzen mit guter Resistenz. Daher ist eine genaue Beurteilung resistenter Maissorten hilfreich. Die Resistenzbewertung umfasst üblicherweise die Bestimmung des Mykotoxingehaltes durch Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gekoppelt mit einem ultra-violett (UV) Detektor und/oder einem Massenspektrometer und die visuelle Abschätzung des Toxingehalts durch die Bewertung der ausgebildeten Symptome. Diese Methoden sind sowohl zeit- als auch kostenintensiv und liefern keinerlei Informationen über die gebildete Pilzbiomasse. Eine neue Methode zur Bestimmung des Befallsgrades einer Pflanze bietet die quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR). Sie ermöglicht das Erkennen einer Infektion noch bevor es zur Ausbildung von Symptomen kommt. Neben dem Einsatz zur Resistenzbewertung kann die qPCR auch für Monitoring Projekte sowie als Screeningmethode für Lebens- und Futtermittelkontaminationen eingesetzt werden. In dieser Arbeit wurde eine Methode zur Quantifizierung für Trichothecen und Fumonisin produzierende Fusarium Stämme in Maisproben entwickelt. Die Methode ermöglicht die Untersuchung einer Vielzahl an Proben in relativ kurzer Zeit durch die parallele Detektion der Gene tri5 und fum1, welche jeweils für die Produktion von Trichothecenen beziehungsweise Fumonisinen notwendig sind. Die entwickelte Methode wurde anhand von 24 natürlich infizierten Maisproben evaluiert. Alle Ergebnisse der multiplex Methode wurden mit den Einzelnachweisen verglichen und in Bezug auf ihre Empfindlichkeit untersucht. Es zeigte sich, dass der entwickelte Nachweis sowohl spezifisch für Fumonisin als auch für Trichothecen produzierende Fusarium Stämme ist. Die Bestimmungsgrenze liegt für beide Fusarium Stämme bei 0.32 pg DNA/µl. Des Weiteren wurden die Trichothecene Deoxynivalenol (DON), DON-3-Glucosid (D3G), Nivalenol (NIV), 3-Acetyl-DON (3-ADON), T-2 Toxin, HT-2 Toxin, Diacetoxyscirpenol (DAS) und Neosolaniol (NEO) sowie die Fumonisine Fumonisin B1 (FB1), Fumonisin B2 (FB2) und Fumonisin B3 (FB3) durch Flüssigkeitschromatographie gekoppelt an Tandem-Massenspektrometrie bestimmt und in Korrelation mit den qPCR bestimmten Ergebnissen gesetzt. Die entwickelte Methode ist der erste multiplex qPCR Test zum quantitativen Nachweis Trichothecen und Fumonisin produzierender Fusarium Stämme. Die Studie wurde im Journal Analytical Methods publiziert (Appendix Publikation #1). Eine weitere wichtige Klasse der Mykotoxine sind unter anderem Aflatoxine. Diese werden vorwiegend von der Gattung Aspergillus und den darin enthaltenen Arten Aspergillus flavus und Aspergillus parasiticus produziert. Vorherrschend ist dabei Aflatoxin B1. Es ist hoch toxisch und wurde von der International Agency for Research on Cancer (IARC) als kanzerogen für Menschen klassifiziert. Zum Schutz der öffentlichen Gesundheit wurden bereits in zahlreichen Ländern Grenzwerte festgelegt, welche sich im Bereich zwischen 1 µg/kg und 20 µg/kg befinden. Dieser Bereich muss zuverlässig nachgewiesen werden können und führt zu der immer stärker steigenden Nachfrage an schnelle, kostengünstige Methoden zur Detektion von AFB1. Die zurzeit bestehenden Methoden basieren auf chromatographischen Verfahren gekoppelt an Massenspektrometrie sowie immunoanalytische Verfahren als rasche Screeningmethoden. Obwohl diese Methoden seit Jahrzehnten etabliert sind, weisen sie bedeutende Nachteile auf. Die benötigten Geräte verursachen hohe Kosten, müssen von geschultem Personal bedient werden und vor-Ort-Tests sind damit kaum realisierbar. Auch die Verwendung von Antikörpern geht mit einigen Einschränkungen einher. Antikörper sind thermisch labil und die Produktion ist aufwendig und kostenintensiv. Aptamer-basierte analytische Methoden bieten eine vielversprechende Alternative zu Antikörpern. In dem zweiten Teil dieser Arbeit wurden Aptamere mit hoher Affinität zu dem Zielmolekül AFB1 entwickelt. Die Aptamere wurden mit einer Prozedur namens SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) gewonnen. Nach vier SELEX Runden wurden die erhaltenen Sequenzen auf ihre Affinität zu AFB1 evaluiert. Fünf Aptamere wurden anschließend in Bezug auf ihre Dissoziationskonstante und ihr Faltungsverhalten charakterisiert. Es wurden Dissoziationskonstanten von 1.30 µM ± 0.14 µM für Aptamer 1 (Lib5_1), 5.70 µM ± 0.54 µM für Aptamer 2 (Lib5_6e), 2.43 µM ± 0.13 µM für Aptamer 3 (Lib5_7e), 2.56 µM ± 0.13 µM für Aptamer 4 (Lib5_9e) und 4.95 µM ± 0.95 µM für Aptamer 5 (Lib5_10e) ermittelt. Für die ersten Versuche zur Entwicklung eines Biosensors (Aptasensors) zur raschen Detektion von AFB1 wurde ein DNA Fragment entwickelt von Neoventures Biotechnology Inc. (Canada) verwendet. Bereits bestehende Aptasensoren basieren auf einem indirekten Nachweisformat. Dabei entsteht ein Signal nur in der Abwesenheit des Zielmoleküls und vice versa. Im Rahmen dieser Dissertation ist ein erster Ansatz eines Teststreifens, basierend auf einem direkten Nachweisformat von AFB1, beschrieben. Dahinter befindet sich die Idee, dass AFB1 zu einer Strukturänderung des Aptamers führt. Dabei kommt es zur Freilegung einer Bindungsstelle und im darauffolgenden Schritt zum Binden einer signalgebenden Sonde. Um die geeignete Temperatur zum Binden (hybridisieren) und Lösen (dehybridisieren) dieser Sonde zu ermitteln, wurden die Temperaturen Raumtemperatur, 37 °C und 40 °C getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass sich 37 °C am besten eignen. Der vorgestellte Ansatz bietet ein neues, noch einzigartiges direktes Nachweisformat für AFB1 mit sofortiger Visualisierung via Teststreifen. Die ersten Ergebnisse wurden bei dem Journal Analytical Methods eingereicht (Appendix Puplikation #2). Zusammenfassend wurde in dieser Dissertation eine multiplex qPCR Methode zur raschen Detektion der wichtigsten Fusarium Arten auf Mais, welche für die Produktion von Trichothecenen und Fumonisinen verantwortlich sind, entwickelt. Außerdem wurde ein erster Ansatz für ein direktes Nachweisformat für AFB1 mittels Teststreifen gezeigt. Die Möglichkeit von Aptameren ihre Struktur verändern zu können trägt großes Zukunftspotential, allerdings sind für einen Prototypen und eine zukünftige kommerzielle Version noch zahlreiche Optimierungsschritte notwendig.