Function of the C-terminal regulatory domain of the cellulase and xylanase regulator XYR1 in Trichoderma reesei

Abstract

Lignocellulose ist die größte erneuerbare Kohlenstoffquelle die heutzutage zur Verfügung steht und stellt somit eine wichtige Alternative zu Erdöl dar. Darum ist Lignocellulose wichtig für die Produktion von Bioethanol und dient ebenso als Rohstoff für Chemikalien. Die Umwandlung von Lignocellulose zu einzelnen Glukose Einheiten beinhaltet vor allem eine enzymatische Hydrolyse der Hauptkomponenten Cellulose und Hemicellulose. Ein weitverbreiteter Produzent von lignocellulolytischen Enzyme stellt der Pilz Trichoderma reesei dar. Die Herstellung der von diesem Pilz produzierte Enzymmischung ist jedoch sehr kostenintensiv und erfordert weitere Forschungen, um eine höhere Ausbeute in der Enzymproduktion zu erzielen. Ein Weg auf der Suche nach neue Strategien für die Stammentwicklung stellt die vergleichende genomische Analyse von Stämmen mit einer starken Cellulase Produktion oder von Stämmen mit einer sehr geringen Cellulase Produktion zu den jeweiligen Elternstämmen dar. Eine genomische Analyse des Stammes QM9136 konnte eine Mutation identifizieren, die zu einem verkürzten XYR1 führt. In diesem verkürzte XYR1 fehlt die vermeintlich C-terminale regulatorische Domäne. Es zeigt sich darüber hinaus, dass beim Wiedereinsetzen eines Wild Typ xyr1 der Phänotyp korrigiert werden konnte, sodass nun eine normale Cellulase Produktion möglich war. Dies lässt darauf schließen, dass die Mutation im xyr1 zu einem Funktionsverlust führt. Um diese Mutation auf molekularer Ebene untersuchen zu können, wurde von einer verkürzten Version des XYR1, das XYR11-780 N-terminal mit einem GFP fusioniert. So war es möglich den Transkriptionsfaktor XYR1 beim Shutteln zwischen dem Kern und dem Zytoplasma unter Cellulase induzierenden Bedingungen beobachtet zu können. Die Analyse zeigte eine basale nukleare Lokalisierung des GFP-XYR11-780. Jedoch konnte keine Erhöhung des GFP-XYR11-780 unter Cellulase induzierenden Bedingungen beobachtet werden im Vergleich zum nicht verkürzten XYR1, welches ebenfalls mit einem GFP N-terminal verbunden wurde (GFP-XYR1). Unter induzierenden Bedingungen zeigte sich, dass die de-novo Biosynthese von XYR1 sehr wichtig ist, um ausreichende Mengen an XYR1 zu produzieren. XYR1 wiederum wird in den Kern transportiert, um dort die Cellulase und Xylanase Transkription zu starten. Die verkürzte Version des XYR1, welches keine C-terminale regulatorische Domäne beinhaltet, verhindert die Hochregulierung von xyr1 und kann durch die Autoregulation erklärt werden. Somit ist das XYR11-780 nicht in der Lage die Cellulase und Xylanase Gen Expression anzuregen.

Lignocellulosic biomass is the largest renewable carbon sources and is used today as important alternative to petroleum for the production of biofuels or platform chemicals. The bioconversion of lignocellulose to monomeric sugars involves also enzymatic hydrolysis of its main components cellulose and hemicellulose. The most common producer of lignocellulolytic enzymes is the fungus Trichoderma reesei. However, its enzyme cocktails are still not cost effective and further research is therefore necessary to improve the yields in enzyme production. One way of finding new targets or strategies for strain improvement is the comparative genomic analysis of cellulase hyperproducing or non-producing strains to their parental strains. Genome analysis of QM9136 identified one mutation which resulted in a truncated XYR1 lacking the putative C-terminal regulatory domain. Reintroduction of the wild-type xyr1 reversed the cellulase negative phenotype of QM9136 while introduction of the mutated version of xyr1 in a xyr1 deletion strain did not result in any phenotype, suggesting that the mutation in xyr1 leads to a loss of function. To investigate the molecular basis of the cellulase negative phenotype caused by the truncated version of XYR1, this XYR11-780 was N-terminal fused to GFP to follow its shuttling dynamics between cytoplasm and nucleus under cellulase inducing conditions. This analysis showed that a basal nuclear localization of GFP-XYR11-780 is found which is, however, not increased during under cellulase inducing conditions as found for a full length version of XYR1 fused to GFP (GFP-XYR1). Upon induction, de-novo protein synthesis of XYR1 is therefore essential for the generation of sufficient amounts of XYR1 which enter the nucleus to actively induce cellulase and xylanase transcription. The XYR1 truncation which lacks the C-terminal domain prevents XYR1 upregulation which can be explained by a XYR1 auto-regulation and is therefore also unable to stimulate cellulase and xylanase induction.