Monitoring viral RNA (common cold virus) transfer into liposomes via molecular beacons and chip electrophoresis

Abstract

It was the aim of my thesis to set up and improve a fast and easy-to-handle analytical approach for detection of viral RNA release from the human rhinovirus (common cold virus) into liposomes employing molecular beacons (MB) and chip capillary electrophoresis. The human rhinovirus is a small, non-enveloped, single-stranded RNA virus that belongs to the family of Picornaviridae and is well known for causing infections of the respiratory system. The viral capsid contains four viral proteins VP1 - VP4, 60 copies each. More than 160 serotypes of the virus are known to date. They can be divided into major and minor type group viruses depending on their receptor binding specificity. Cell infection normally takes place by clathrin-mediated endocytosis initiated by a cell surface receptor. The idea was to set up an in vitro system to simulate the in vivo cell infection of the human rhinovirus serotype HRV-A2 employing liposomes, lipid bilayer vesicles, as cell models. Liposomes in different lipid composition were applied. Additionally, the influence of a HRV-A2 specific recombinant MBPV33333 receptor as additive was investigated regarding the RNA transfer into the liposome nanoparticle. As presented by Okun and colleagues (Analytical Chemistry 1999, 71 (20), 4480 - 4485) viral uncoating can be introduced either by increased temperature or by acidification to a pH lower than 5.8 to simulate the endosomal environment. For detection a fast, sensitive and straightforward method for monitoring of the viral RNA release into the liposomes was required. Therefore a strategy using MBs and chip capillary electrophoresis (CE) was introduced and optimized during this master thesis. MBs are small probes which fluoresce upon hybridization to a complementary sequence. Three of these probes are designed to bind to complementary sequence regions of the HRV-A2 genome. Challenges like decreasing stability of the MBs in different buffers systems and the influence of divalent cations like Mg2+ on the MBs had to be handled during this thesis. Weiss et.al. presented that the additive Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid), which is known for reduction of bleaching and blinking of fluorophores, increases the sensitivity of the chip CE setup by up to a factor of three (Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2016, 408 (16), 1-9). However, in my work it was also shown that the reactivity of the MBs towards complementary oligonucleotide sequences deteriorates with increasing storage time due to the Trolox in the buffer. Hence, the sample buffer was modified to improve the storage conditions in order to retain the MBs- reactivity. In particular, four different HRV-A2 preparations were selected for this work. We were able to detect viral RNA release into solution after heating the sample to 56 °C for 15 min as well as after acidification to pH < 5.6. In addition viral material was incubated with various liposomes containing different MBs in various concentrations. RNA release into the liposome was detected in presence of a specific receptor to form a direct link between the cell model and viral capsid for two virus preparations. In absence of the receptor only partial release out of the virion was detected on the chip CE device. In summary, detection of viral RNA transfer into liposomes as cell models is possible with the applied chip CE method using selected MBs. Our results suggest that the RNA transfer into the liposomes requires a receptor that is specific for HRV-A2.

Das Ziel der hier vorliegenden Arbeit war es, eine schnelle und einfach zu handhabende analytische Strategie zu etablieren, um die Freisetzung von viraler RNA aus dem humanen Rhinovirus (umgangssprachlich Schnupfenvirus) in Liposome als Zellmodell zu verfolgen. Zur Detektion sollen Molecular Beacons (MBs) in Kombination mit Chip-Kapillar-Elektrophorese eingesetzt werden. Der humane Rhinovirus ist ein relativ kleines Virus ohne Lipidhülle mit einzelsträngiger RNA, das zur Familie der Picornaviridae gehört. Das humane Rhinovirus ist vor allem dafür bekannt, dass es Infektionen der Atemwege hervorruft. Das virale Kapsid ist aus vier viralen Proteinen VP1 - VP4 aufgebaut, welche jeweils in Form von 60 Kopien vorhanden sind. Bisher sind mehr als 160 Serotypen dieses Virus bekannt. Diese können in major type und minor type Viren eingeteilt werden. Diese Einteilung beruht auf der Spezifität der Rezeptoren, die Viren für die Zellinfektion benötigen. Zellinfektion wird in der Regel durch Clathrin-vermittelte Endozytose durch einen Zelloberflächenrezeptor initiiert. Ziel des Projekts war es, ein in vitro System zu etablieren, um die in vivo Zellinfektion des humanen Rhinoviruses (Serotyp HRV-A2) durch den Einsatz von Liposomen als Zellmodell zu simulieren. Liposome, Lipid-Doppelschicht-Vesikel, in verschiedenen Lipidzusammensetzungen wurden mit dem viralen Material in Kontakt gebracht. Zusätzlich wurde dieser Ansatz um einen HRV-A2 spezifischen, rekombinanten MBP-V33333-Rezeptor erweitert und sein Einfluss auf den RNA Transfer in das Liposomnanopartikel betrachtet. Wie bereits von Okun und Koautoren (Analytical Chemistry 1999, 71 (20), 4480 - 4485) berichtet, kann die Freisetzung des viralen Genomes entweder durch erhöhte Temperatur oder durch Ansäuern auf einen pH Wert < 5.8, um die endosomale Umgebung zu simulieren, erzielt werden. Zur Beobachtung des viralen RNA Transfers in die Liposome ist eine schnelle, sensitive und einfache Analysenstrategie erforderlich. Dafür galt es, ein Setup für die Technik Chip-Kapillarelektrophorese (Chip CE) unter Verwendung von MBs zu entwickeln und während dieser Masterarbeit zu optimieren. MBs sind kleine Fluoreszenzsonden, die bei der Hybridisierung an eine komplementäre Sequenz fluoreszieren. Drei dieser Sonden, die spezifisch an Abschnitten des HRV-A2 Genoms binden, wurden in dieser Arbeit eingesetzt. Herausforderungen wie die abnehmende Stabilität der MBs in verschiedenen Puffer-Systemen und der Einfluss von divalenten Kationen wie Mg2+ auf die MBs mussten während dieser Arbeit gemeistert werden. Wie in der Publikation von Weiss et al. (Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2016, 408 (16), 1-9) beschrieben wurde, verringert der Zusatz von Trolox (6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchroman-2-carbonsäure) das Ausbleichen und Blinken des Fluorophors. Dies erhöht die Empfindlichkeit des Chip- CE Setups um bis zu einen Faktor drei. In der hier vorliegenden Arbeit wurde jedoch gezeigt, dass die Reaktivität der MBs gegenüber den komplementären Oligonukleotiden über längere Lagerzeit aufgrund von Trolox im Puffer abnimmt. Daher wurde der Probenpuffer für verbesserte Lagerbedingungen entsprechend angepasst um die Reaktivität der MBs zu erhalten. Während dieser Arbeit wurden vier verschiedene hochreine HRV-A2 Präparationen untersucht. Nach Erhitzen der Proben auf 56 ° C für 15 min bzw. nach Ansäuern auf pH <5.6 konnte die Freisetzung viraler RNA in Lösung mittels der entwickelten Strategie detektiert werden. Weiters wurden verschiedene Liposome, die verschiedene MBs in unterschiedlichen Konzentrationen in ihrem Lumen beinhalteten, verwendet um den RNA Transfer zu studieren. Die Freisetzung der RNA in Liposome wurde in Gegenwart des spezifischen Rezeptors für zwei Viruspräparate gezeigt. Durch II Einsatz des Rezeptors konnte eine direkte Verbindung zum Zellmodell gezeigt werden und eine Interaktion mit dem viralen Kapsid erzielt werden. In Abwesenheit des Rezeptors konnte nur eine teilweise Freisetzung der RNA aus dem Virion mittels des MB Chip CE Ansatzes gezeigt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Nachweis von viralem RNA Transfer in Liposome mit dem hier präsentierten CE-System unter Einsatz von MBs möglich ist und damit eine Bestätigung des Zellmodells erzielt werden konnte. Die Ergebnisse zeigten, dass für den Transfer von RNA in die Liposome die Anwesenheit eines spezifischen Rezeptors von wesentlicher Bedeutung ist. III