Increased information to effort ratio through physiological bioprocess development

Abstract

Escherichia coli ist der am häufigsten genutzte Organismus für die rekombinante Proteinproduktion mit Bioprozessen [1, 2]. Während der Prozessentwicklung im Labor bis hin zum Produktionsmaßstab, werden kritische Prozessparameter identifiziert und anschließend untersucht. Das Ziel ist die Gernerierung von möglichst produktunabhängigem und damit transferierbarem Prozessverständnis um den Aufwand für die neuerliche Bioprozessentwicklung zu minimieren. Derzeitig werden Bioprozesse häufig anhand technischer Parameter entwickelt z.B. volumetrischer Fütterungsraten, was die Transferierbarkeit des Prozessverständnis limitiert. Nach Jahrzehnten der technologieorientierten Prozessentwicklung findet nun eine Umorientierung auf physiologische Parameter statt [3-6]. Unterteilt in einen analytischen und einen methodischen Teil, wird in dieser Dissertation der Mehrwert physiologischer Bioprozessentwicklung im Vergleich zu herkömmlichen Ansätzen analysiert und bewertet. 1) Methodenentwicklung und Bewertung zur Quantifizierung physiologischer Prozesse und Phänomene bzgl. Robustheit und Sensitivität: - Als Begeleiterscheinung von Zelllyse werden zytosolische Proteine freigesetzt [7]. Der analytische Fehler der Proteinquantifizierung wurde auf Probenmatrixeffekte zurückgeführt und durch methodische Adaption von >200% auf <50% reduziert. - Protein Expression führt häufig zum physiologischen Phänomen der Inclusion body (IB) Bildung. Um das Wachstum der IBs als Auswirkung der Expressionsrate quantifizierbar zu machen, wurde Nano Particle Tracking Analysis als neue Methode für die Größenbestimmung von IBs etabliert und verifiziert. - Physiologische Bioprozesskontrolle bedarf einer akkuraten Bestimmung der Biomasse bereits in der frühen Phase der Bioprozessentwicklung. Für Biomasseschätzung in Echtzeit, hat sich die per gewichtetem Mittelwert kombinierte, massenbilanzbasierede Softsensorenschätzung als praktikabelste Methode (Information/Aufwand) erwiesen. 2) Analyse der Vor und Nachteile physiologischer Bioprozessentwicklung anhand industriell relevanter Produktionsprozesse: - Physiologische Bioprozesentwicklung fußt auf numerischen, physiologischen Deskriptoren, spezifisch für definierte Prozessphasen. Eine neue substratverbrauchsbasierte Grundlage zur Phasendefinition wurde vorgestellt und ein Schema zur Integration von vorhandenem Prozesswissen in die Versuchsplanung anhand eines Beispiels illustriert. - Eine physiologische Fütterungsstrategie bedarf der präzisen Definition physiologischer Limits z.B. des kritischen qS (qScrit). Mit Hilfer kontrollierter Oszillationen von qs, konnte eine starke Abhängigkeit von der Zeit sowie von der metabolischen Aktivität gezeigt werden. Folglich bedarf es einer prozesstechnologischen Strategie um das dynamische Verhalten von qScrit auch in Echtzeit zu erkennen und abzufangen. - Basierend auf einer Kombination aus Softsensoren wurde eine Closed-Loop-Echtzeit Kontrollstrategie für qS etabliert. Mit dieser Kontrollstrategie war es möglich die sonst verbreitete Anhäufung von Substrat in der späten Induktionsphase zu vermeiden. In dieser Dissertation werden die Vor- und Nachteile physiologischer Bioprozessentwicklung umfassend analysiert und diskutiert. Physiologische Bioprozessentwicklung ermöglicht tiefe Einblicke in physiologische Prozesse und fördert das generelle Verständis für das Verhalten des Produktionsstammes unabhängig von einem Produktivitätsgewinn. Physiologische Bioprozesskontrolle stellt das Rückgrat für physiologische Prozessentwicklung dar und kann Experimente zur Stammcharakterisierung offenbar sogar ersetzen. Sie eröffnet neue Möglichkeiten in der Prozessentwicklung, möglicherweise auch eine Steigerung der Raum/Zeitausbeute. Physiologische Bioprozessentwicklung verlangt anfänglich nach einem erhöhten Aufwand für die Implementierung der Analytik sowie der Kontrollalgorithmen, doch nachhaltig lohnt sie sich und erhöht das Informations zu Aufwandsverhältnis substantiell.

Escherichia coli is one of the most exploited organisms for industrial production of recombinant proteins using bioprocesses [1, 2]. Within process development, critical process parameters are identified and consequently investigated from lab to production scale. In order to minimize process development effort the generation of product independent, transferable prior process knowledge is of utmost interest. Currently, bioprocesses are commonly developed based on technical process parameters as e.g. volumetric feeding rates, generating hardly transferable, technology oriented process knowledge. After decades of focusing on technical parameters, a more physiological approach has emerged [3-6]. Structured in two parts, this thesis aims to establish and assess physiological bioprocess development as well as to analyze whether it bears significant advantages compared to conventional approaches. 1) Establishment and investigation of analytical methods to quantify and detect physiological processes and phenomena with respect to accuracy and robustness: - Cell lysis, as physiological event, features cytosolic protein release [7]. For protein quantification in complex sample matrixes the error of the method was reduced from >200% to <50%. - High titer expression of protein frequently features the physiological phenomena of inclusion body (IB) formation. To analyze the IB growth as an effect of expression rates, the novel method of nano particle tracking analysis for IB sizing was established and successfully verified. - Physiological bioprocess control requires accurate biomass estimation. In the context of early bioprocess development, a weighted average combination of first principle soft sensors was proven the most suitable approach for real time biomass estimation. 2) Analysis of the advantages and challenges of physiological bioprocess development at hand of industrial relevant production processes. - Physiological bioprocess development requires single numerical descriptors of physiology representing distinct process phases. Therefore, a novel variable for physiological phase definition and a workflow to increase process knowledge integration was illustrated. - A physiological feeding strategy based on the specific substrate uptake rate (qS), in comparison to technological feeding profiles, was shown to be highly beneficial in terms of product titer. - Physiological process control requires the accurate definition of physiological limits e.g. the critical qS (qScrit). Using controlled oscillations of qS, qScrit was shown to be highly dependent on time after induction and on the average metabolic activity qSmean. The latter finding calls for technological strategies to cope with the dynamic nature of qScrit. - Using a combination of first principle softsensors a closed loop real time control approach of qS was established. Hereby, substrate accumulation in late process phases was effectively avoided. This thesis comprehensively discusses advantages and challenges of physiological bioprocess development. Physiologic process development grants deeper insights into relevant physiological processes and fosters the general understanding of the behavior of the production strain regardless of an associated titer increase. Physiological bioprocess control approaches, as the backbone of physiological bioprocess development are even able to substitute strain characterization experiments. It grants additional degrees of freedom and thereby potentially allows for higher time space yields. It can be concluded, that physiological bioprocess development asks for a one time effort investment for the establishment of sensitive analytics and physiological control approaches but on the long term it rewards with a substantial increase in information to effort ratio.