New approaches to DNA isolation methods from food and feed-derived products

Abstract

Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Entwicklung neuartiger DNA-Isolierungsmethoden aus Lebensmitteln und Futtermitteln unter Verwendung verschiedener Strategien. In jüngster Zeit hat sich die Verwendung ionischer Flüssigkeiten (ILs) aufgrund ihrer hervorragenden Eigenschaften zum Auflösen von Biomasse und Biopolymeren als innovatives Lösungsmittel für die Biomasseverarbeitung herauskristallisiert. In der ersten Studie dieser Arbeit wurde eine neuartige, einfach anzuwendende und zeiteffiziente Methode zur direkten Extraktion von genomischer DNA (gDNA) aus gentechnisch verändertem Mais auf Basis wässriger IL-Lösungen entwickelt. Das einfache Protokoll beruht auf der Extraktion von Mais in einer 10 wt% Lösung von ILs in wässrigem Phosphatpuffer (Na2HPO4/NaH2PO4, 50 mM, pH = 8,5) für 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT), gefolgt von einem Inkubationsschritt bei 95 C für 10 min, um coextrahierte Proteine zu denaturieren. Anschließend erfolgt eine einfache Filtration über eine PTFE-Membran (0,2 m) zur Entfernung von Polymerresten. Ein Set von 22 ILs wurde in einem Puffersystem getestet und 1-Ethyl-3-methylimidazoliumdimethylphosphat ([C2mim] Me2PO4) sowie das umweltfreundlichere Cholinformiat ([chol]fom) wurden als ideale Kandidaten identifiziert. Mit dieser Strategie konnte die Qualität der extrahierten gDNA signifikant verbessert und das Extraktionsprotokoll im Vergleich zu einer etablierten Methode stark vereinfacht werden. Nach bestem Wissen des Autors war diese Arbeit die erste veröffentlichte Studie, in der eine schnelle und effiziente Strategie vorgestellt wurde, die auf neuartigen IL-Technologien zur Extraktion von DNA direkt aus einer komplexen natürlichen Matrix basiert. Der Redakteur der Fachzeitschrift Analytical and Bioanalytical Chemistry wählte diese Publikation, wie von den Peer Reviewern betont, als Ausnahmeartikel für eine schnelle Veröffentlichung und damit als „Paper in Forefront“ aus. Die Vielseitigkeit der zuvor vorgeschlagenen IL-basierten Methode wurde auf eine weitere Studie zur Entwicklung eines Verfahrens zur Extraktion mitochondrialer DNA (mtDNA) aus Fleisch und Fleischprodukten ausgeweitet. Zu diesem Zweck wurde ein Set von 20 ILs untersucht, von denen das umweltfreundliche Cholinhexanoat in Kombination mit einem Phosphatpuffer die vielversprechendsten Ergebnisse lieferte. In diesem Fall wurden 100 mg IL in 900 L Puffer gelöst und 200 mg Fleisch zugegeben. Es folgte ein optionaler Rührvorgang für 15 min bei RT, ein Denaturierungsvorgang für 10 min bei 95 C und eine anschließende Zentrifugation bei 13.000 U/min für 4 min. Der resultierende Überstand wurde dann zur weiteren Analyse bei -20 oC gehalten. Die Extraktion erfolgte in verschiedenen Fleischsorten wie Rind, Schwein und Pferd in deutlich höheren Erträgen als im reinen Phosphatpuffer. Mit dieser IL extrahierte DNA zeigte eine hohe Spezifität, da bei der Durchführung einer Agarosegelelektrophorese keine Nebenprodukte nachgewiesen wurden, eine hohe Ausbeute aufwiesen und bei 20-tägiger Lagerung bei RT stabil waren. Darüber hinaus wurde der Einfluss der IL auf den Amplifikationsprozess während der qPCR untersucht, wobei ein inhibitorischer Effekt mit zunehmender Kettenlänge der IL und höheren Konzentrationen an ionischen Flüssigkeiten gezeigt wurde. Zusammenfassend ist das entwickelte Verfahren von großem Vorteil, da es nicht nur die Verwendung toxischer und flüchtiger organischer Lösungsmittel vermeidet, die in anderen Extraktionsmethoden und kommerziellen Kits zu finden sind, sondern auch einen zeit- und energiesparenden Prozess bietet. Eine dritte Studie befasste sich mit der Entwicklung einer schnellen gDNA-Extraktionsmethode und ihrer Kombination mit einer helikaseabhängigen Amplifikation zum Nachweis von gentechnisch verändertem Mais. Das Verfahren basiert auf dem Einsatz eines wässrigen Puffersystems in Kombination mit einem Proteinase K-Verdau. Darauf folgt später eine helikaseabhängige Amplifikation als Alternative zur PCR zum Nachweis von transgenem Mais durch Screening auf den P35S-Promotor in den Maissorten NK603, Bt-11 und MON810. Die erhaltenen Daten entsprachen denen, die mit der komplexeren CTAB-Extraktionsmethode oder dem Promega Wizard DNA Aufreinigungskit erzielt wurden. Die in dieser Studie vorgestellte gDNA-Isolierungsmethode kann vor Ort durchgeführt werden und ist kostengünstig, einfach und zeitsparend. Die in dieser Arbeit vorgestellten entwickelten Methoden gelten als Ausgangspunkt für zukünftige Extraktionsverfahren der neuen Generation. Durch die Anwendung neuer Isolierungsstrategien wird der immer noch bestehende Engpass komplexer, zeitaufwändiger und laborabhängiger Isolierungsprotokolle behoben. Sie vermeiden Wasch- und Filtrationsschritte und reduzieren so die Abfallansammlung. Im Vergleich zu konventionellen Methoden und kommerziellen Kits führen sie zu einfachen, kostengünstigen und viel schnelleren Extraktionsverfahren und liefern zuverlässige Ergebnisse sowie einen geringen ökologischen Fußabdruck.

The present work focuses on the development of novel isolation methods of DNA from food and feed derived products by using different strategies. Recently, the use of ionic liquids (ILs) has emerged as innovative solvents for biomass processing, due to their excellent properties for dissolving biomass and biopolymers. In the first study of this thesis, a novel, easily applicable and time efficient method for the direct extraction of genomic DNA (gDNA) from genetically modified maize based on aqueous IL solutions was developed. The straightforward protocol relies on the extraction of maize in a 10 wt% solution of ILs in aqueous phosphate buffer (Na2HPO4/NaH2PO4, 50 mM, pH = 8.5) for 5 min at room temperature (RT), followed by an incubation step at 95 C for 10 min for denaturing coextracted proteins. Afterwards, a simple filtration over a PTFE membrane (0.2 m) to remove residual polymers is performed. A set of 22 ILs were tested in a buffer system and 1-ethyl-3-methylimidazolium dimethylphosphate ([C2mim]Me2PO4), as well as the more environmentally benign choline formate ([chol]fom), were identified as ideal candidates. With this strategy, the quality of gDNA extracted was significantly improved and the extraction protocol was simplified to a large extent when compared to a well-established method. To the best of the author s knowledge, this work was the first published study to present a fast and efficient strategy based on novel IL technologies for the extraction of DNA directly from a complex natural matrix. As emphasized by the peer reviewers, the editor from the journal Analytical and Bioanalytical Chemistry selected this publication as an exceptional paper for rapid publication and thus as a “Paper in Forefront”. The versatility of the previously proposed method based on ILs was expanded to another study for develop a procedure to extract mitochondrial DNA (mtDNA) from meat and meat derived products. A set of 20 ILs was investigated for this purpose, from which the environmentally benign choline hexanoate combined with a phosphate buffer gave the most promising results. In this case, 100 mg of IL were dissolved in 900 L buffer and 200 mg of meat were added. This was followed by an optional stirring process for 15 min at RT, a denaturation process for 10 min at 95 C and a subsequent centrifugation at 13,000 rpm for 4 min. The resulting supernatant was kept then at -20 C for further analysis. The extraction was carried out in different types of meat such as beef, pork and horse in significantly higher yields compared to the pure phosphate buffer. DNA extracted with this IL showed high specificity as no by-products were detected when performing an agarose gel electrophoresis, had a high yield and was stable when stored at RT for 20 days. Furthermore, the influence of the IL on the amplification process during qPCR was investigated, showing an inhibitory effect with increasing chain length of the IL and higher ionic liquid concentrations. As a summary, the developed method is highly advantageous, as it not only avoids the use of toxic and volatile organic solvents which can be found in other extraction methods and commercial kits, but it also provides a time and energy saving process. A third study involved the development of a rapid gDNA extraction method and its combination with helicase dependent amplification to detect genetically modified maize. The method is based on the employment of an aqueous buffer system in combination with a proteinase K digestion. This is later followed by a helicase dependent amplification, as an alternative to PCR to detect transgenic maize by screening for the P35S promoter in the maize varieties NK603, Bt-11 and MON810. Data obtained were similar to those achieved with the more complex CTAB extraction method or the Promega Wizard DNA purification kit. The gDNA isolation method as presented in this study can be performed on-site, is inexpensive, simple and time saving. The developed methods presented in this thesis are considered to be a starting point for future new generation extraction procedures. The application of new isolation strategies will remove the still existing bottleneck of complex, time consuming and laboratory dependent isolation protocols. They avoid washing and filtration steps and thus reduce accumulation of waste. When compared to conventional methods and commercial kits, they result in simple, inexpensive and much more faster extraction procedures, while providing reliable results and a low environmental footprint.