Flow regulation of hemostasis by the mechano-sensitive protein von Willebrand Factor

Abstract

Das hochmolekulare, lineare multimere Glykoprotein von Willebrand Faktor (VWF) ist ein unverzichtbarer Bestandteil des Bluts von Säugern und Menschen. Es erfüllt eine Reihe von wichtigen Funktionen in der Hämostase, des Tumorwachstums und der Angiogenese doch eine andere wichtige Seite seines Wirkungsbereichs ist sein thrombogenes und entzündungsförderndes Potenzial. VWF ist der Schlüssel zu zum Verständnis des konterintuitiven Phänomens der durch hydrodynamische Kräfte verstärkten primären Hämostase (das ist die Bildung eines primären Thrombozytenaggregats). Scherströmung und andere divergente Strömungsformen verursachen ein Entwirren und teilweises Entfalten der multimeren VWF Ketten, die sonst als lose Knäul zirkulieren. Ein Strecken von VWF ist verbunden mit einer Aktivierung von kritischen Funktionen, wie die Bindung an Kollagen und an Blutplättchenrezeptoren (primäre Hämostase) und die Zugänglichkeit für proteolytische Spaltung, was wiederum das thrombogene Potenzial reguliert. Diese mechanische Regulation macht VWF zum Scherratensensor des Blutes. In dieser Dissertation wurde die Rasterkraftmikroskopie (AFM) im sogenannten 'tapping' Modus und ein eigens konstruiertes 2-Platten-rheometerartiges Gerät verwendet, um auf Einzelmolekülebene, die Reaktionen von gestreckten rekombinat hergestellten, multimeren VWF Ketten zu studieren. Dazu wurde eine Methode entwickelt mit der einzelne multimere VWF Moleküle an einer Trägeroberfläche lokalisiert und auch nach Interaktionsstudien wiedergefunden werden können, um davon AFM Bilder vor und nach einer Bindung mit einem rekombinanten Faktor VIII (FVIII) aufzunehmen. FVIII ist essentiell an der Aktivierung der sekundären Hämostase beteiligt, doch seine geringe Stabilität in humanem Plasma verlangt nach der stabilisierenden Komplexbildung mit VWF. Als nächstes wurde ein mikrofluidisches, rheometerartiges Gerät verwendet, mit dem einzelne VWF Moleküle bei exakt definierten Scherraten (mechanisch) gestreckt werden können. Kombination dieser beiden Methoden und die Interaktion der Protease ADAMTS13 in Lösung mit dem Glykoprotein als Kontrolle, führte zum unerwarteten Ergebnis, dass FVIII nur bei geringen bis mittleren Scherraten an VWF bindet, während bei hohen Scherraten FVIII freigesetzt wird, was den selektiven Transport von FVIII zu Bereichen mit beschädigtem Endothel erklärt. Schließlich wurde auch reiner FVIII mit AFM untersucht und ein Ca2+-abhängiger Voraktivierungs- und Selbststabilisierungs-Mechanismus gezeigt.

The high molecular mass linear chain multimeric glycoprotein von Willebrand factor (VWF) is an indispensable component of mammalian (including human) blood. It serves multiple beneficial roles in hemostasis, cancer suppression and angiogenesis but in turn has also thrombogenic and pro-inflammatory potential. VWF is the key to understand the counter-intuitive observation that primary hemostasis (that is, platelet recruitment at sites of vascular injury to form a preliminary plug and quickly stop bleeding) is not disturbed but enhanced by hydrodynamic flow. Shear-flow and other divergent (elongational) flow conditions can cause an unravelling and partial unfolding (-stretching-) of the VWF multimeric chains which are otherwise loosely coiled in circulation. Stretching VWF goes along with an activation of crucial functions such as binding to collagens of vessel walls and platelet receptors (primary hemostasis) and susceptibility to proteolytic cleavage which downregulates its own thrombogenic potential. This mechanical activation makes VWF the flow sensor of blood. In this thesis, atomic force microscopy (AFM) in the tapping mode was used and a homebuilt 2-plate-rheometer-like device was applied to study reactions of stretched VWF chains at single molecular level. First, a method was developed to retrieve an individual single glycoprotein molecule enabling before-and after imaging of a recombinant VWF-Factor VIII (FVIII) binding. FVIII is essential for the activation of secondary hemostasis but its stability in the circulation is dependent on its complex formation with VWF. Next, a microfluidic rheometer device was developed which is capable to stretch single molecule VWF chains at well-defined shear-rates. Combining these two devices, and introducing the protease ADAMTS13 as a control, provided the unexpected result that FVIII only binds FVIII at low/moderate shear-rates whereas high shear-stretching elicit a release of FVIII, explaining a targeting mechanism of FVIII to sites of injured endothelium. Finally, also FVIII as such was investigated by AFM revealing a Ca2+-linked pre-activation and self-stabilizing mechanism.