The regulation of hemicellulose metabolism and its metabolite pools in filamentous fungi

Abstract

Hemicelluloses are complex heterogenous polysaccharides that beside cellulose and pectin contribute to the main parts of plant cell walls. Among the microorganisms capable of hemicellulose degradation the saprobic ascomycete Trichoderma reesei represents a paradigm for the biochemistry and regulation of fungal hemicellulose degradation.<br />Moreover, the extracellular secreted xylanases find applications in different industrial processes including biobleaching of kraft pulp, as additive to dough and animal feed and filtration of juices or in the depolymerization of plant cell walls for biofuels and different biorefinery products. Optimizing xylanase production in industrial fungal strains requires exact knowledge about the basic molecular mechanisms that underlie regulation and expression of the xylanase genes. This work adresses numerous questions of hemicellulose metabolism and regulation, i.e. a survey on T. reesei xylanases, the intracellular degradation of hemicellulose derived sugars resulting from enzymatic decomposition by different hemicellulases and the inducer formation for these enzymes within the catabolic pathways. The T. reesei genome harbors at least five xylanases including the GH11 family xylanases xyn1, xyn2 and xyn5, GH10 family xyn3 and GH30 xylanase xyn4. The major hemicellulosic pentoses D-xylose and L-arabinose function as independent inducers that can act in a synergistic manner to trigger the expression of some of the xylanase genes. Transcriptional regulation is further influenced by the carbon catabolite repressor CRE1 and the general activator XYR1. Interruption of the first two catabolic steps in the degradation of D-xylose and L-arabinose enhances induction levels of the main xylanases. With respect to the intracellular catabolism two missing links in the degradation of L-arabinose and D-galactose were identified.<br />These include a novel short-chain reductase with a key role in the oxido-reductive D-galactose degradation pathway which is in T. reesei encoded by the L-xylo-3-hexulose reductase lxr4 and in Aspergillus niger by xhrA. Both enzymes catalyze the conversion of L-xylo-3-hexulose to D-sorbitol using NADPH as cofactor but are phylogenetically not closely related. Deletion of these genes resulted in the inability of both fungi to grow on galactitol as sole carbon source. In L-arabinose catabolism the T. reesei LXR3 was identified as a novel enzyme responsible for NADPH dependent L-xylulose to xylitol reduction. This enzyme is again not closely related to its A. niger counterpart LxrA. These new insights on the regulation of xylanases and on the biochemistry of the different 2 monosaccharide catabolic pathways significantly contribute to our understanding of the complexity of hemicellulose degradation, metabolism and enzyme regulation in filamentous fungi and show that fungi have evolved different strategies to regulate the extracellular hemicellulases and intracellular assimilation of hemicellulose derived monosaccharides.

Hemizellulose ist ein Sammelbegriff für komplexe heterogene Mehrfachzucker, welche neben Zellulose und Pektin den größten Teil pflanzlicher Zellwände ausmachen. Einige spezialisierte Mikroorganismen sind im Stande effizient Hemizellulose abzubauen und zu verwerten.<br />Darunter befindet sich der saprobe Ascomycet Trichoderma reesei, welcher als ein Modellsystem für Biochemie und Regulation des Hemizelluloseabbaus in Pilzen gilt. Die extrazellulär sekretierten Xylanasen und Zellulasen dieses Pilzes finden in einem breiten Spektrum an industriellen Prozessen Anwendung, unter anderem im Biobleichen von Zellstoff, als Zusatz in Teig- und Tierfuttermitteln und in der Filtration von Fruchtsäften, sowie im Abbau von Pflanzenbiomasse zu einfachen Zuckern, die weiter zu Biokraftstoffen oder verschiedenen Bioraffinerieprodukten umgesetzt werden können. Die gezielte Optimierung der Xylanaseproduktion industrieller Pilzstämme erfordert ein umfassendes Wissen über die molekularen Mechanismen, die der Regulation und Expression der Xylanasegene zu Grunde liegen. Die vorliegende Arbeit behandelt verschiedene Fragestellungen betreffend Hemizellulosemetabolismus und -regulation. Die Xylanasen in T. reesei und deren Induzierbarkeit durch Metabolite, die im Zuge der intrazellulären Verstoffwechselung von Abbauprodukten langkettiger Hemizellulosen entstehen, werden dabei umfassend beleuchtet. Das Genom von T. reesei umfasst mindestens fünf Xylanasen. Dazu zählen die der GH11 Familie zugehörigen xyn1, xyn2 und xyn5, die GH10 Xylanase xyn3 und xyn4, welche der GH30 Familie zugeordnet wird. D-xylose und L-arabinose, die am häufigsten in Hemizellulose vorkommenden Pentosen, induzieren unabhängig voneinander die Expression dieser Xylanasegene und zeigen einen synergistischen Effekt betreffend der Induktion einiger Xylanasen.<br />Die transkriptionelle Regulation der Xylanasegene wird des Weiteren über den Aktivator XYR1, sowie über Kohlenstoff Katabolit Repression durch den Transkriptionsfaktor CRE1 erreicht. Eine Unterbrechung der ersten beiden enzymatischen Schritte im Stoffwechselabbauweg von D-Xylose und L-Arabinose verstärkt die Expression der für den Abbau von Arabinoxylan wichtigsten Xylanasen. In Bezug auf den intrazellulären Katabolismus konnten im Zuge dieser Arbeit zwei bis dato unbekannte Enzyme identifiziert und charakterisiert werden, die eine maßgebliche Rolle im Abbau von L-Arabinose und D-Galactose spielen. Dies ist zum ersten eine kurzkettige Dehydrogenase, welche eine Schlüsselrolle im oxido-reduktiven D-Galactose Abbau spielt und in T. reesei durch das L-Xylo-4 3-hexulose 4 Gen lxr4 und in A. niger durch xhrA kodiert wird.<br />Beide Enzyme katalysieren die Reaktion von L-Xylo-3-hexulose zu D-Sorbitol mittels NADPH als Cofaktor, jedoch sind sie nicht nahe miteinander verwandt. Die Deletion dieser Gene resultiert im Verlust der Fähigkeit auf Galactitol als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen. Im L-Arabinose Stoffwechselweg von T. reesei wurde LXR3 als neues Enzym identifiziert, welches abhängig von NADPH L-Xylulose zu Xylitol reduziert. Auch diese kurzkettige Reduktase ist nicht nahe mit seinem Gegenstück LxrA in A. niger verwandt. Zusammengefasst tragen diese neuen Einblicke in die Mechanismen der Xylanaseregulation und die Biochemie der Stoffwechselwege verschiedener hemizellulosestämmiger Monosaccharide signifikant dazu bei, die Komplexität des enzymatischen Hemizelluloseabbaus durch filamentöse Pilze besser zu verstehen und zeigen, dass Pilze im Laufe der Evolution unterschiedliche Strategien entwickelt haben, ihre extrazellulären Hemizellulasen zu regulieren und die Abbauprodukte der Hemizellulosen zu verstoffwechseln.<br />