Entwicklung einer Analysenmethode zur Bestimmung von Östrogenen im Oberflächengewässer und Abwasser mittels Online-SPE-LC-MS/MS

Abstract

Estron (E1), 17β-Estradiol (E2) und 17α-Ethinylestradiol (EE2) zählen zu den Vertretern der Steroidhormone und zeigen bereits in geringen Konzentrationen negative Auswirkungen auf das endokrine System, sie werden daher auch als endokrine Distruptoren bezeichnet. Der Eintrag in die europäischen Gewässer erfolgt in einem hohen Maß über Kläranlagenabläufe, die als Punktquelle kontinuierlich Östrogene in die Umwelt freisetzen, da ein vollständiger Abbau über die unterschiedlichen Stufen der Kläranlage nicht erreicht wird. Die stetige Exposition an E1, E2 und EE2 führt zu einer nachweisbaren schädlichen Wirkung auf aquatische Lebewesen und die menschliche Gesundheit. Aus diesem Grund hat die EU-Kommission die untersuchten Östrogene auf die Beobachtungsliste im Zuge der Wasserrahmenrichtlinie gesetzt. Dort werden, wegen des hohen Wirkungspotentials, Nachweisgrenzen im pg/L-Bereich (400 pg/L für E1 und E2 sowie 35 pg/L für EE2) festgelegt, die mit dem heutigen Stand der Technik eine analytische Herausforderung sind. Im Zuge dieser Arbeit sollte nun eine zuverlässige, routinetaugliche und empfindliche Analysenmethode zur Bestimmung von E1, E2 und EE2 in Oberflächengewässern und Abwasser mit Hilfe der online-SPE-LC-MS/MS entwickelt werden. Als Realproben dienten Kläranlagenabläufe aus den regionalen Kläranalagen in der Umgebung von Duisburg (Deutschland), sowie Rheinwasser als Vertreter für Oberflächengewässer. Die Ansatzpunkte der Methodenentwicklung können dabei in drei große Bereiche eingeteilt werden. So wurden zunächst in der Entwicklung und Optimierung einer geeigneten analytischen Trenn- und Detektionsmethode unter anderem als Laufmitteladditive Ammoniumfluorid untersuchst, das durch die Bildung eines [M-F]--Addukts und Zerfall in der Gasphase zu [M-H]- eine Signalsteigerung von bis zu 800% ermöglicht. Eine Auswahl der geeigneten Trennsäule für das Analysensystem erfolgte anhand definierter Kriterien wie Ausmaß der Trennung der Analyten, Abtrennung von Störkomponenten in der Form von Störpeaks und coeluierender Matrix, wobei eine Restek Raptor Biphenyl Säule für die finale analytische Methode gewählt wurde. Im Zuge der Optimierung unterschiedlichster MS-Parameter erwies sich die Methode als weitgehend robust gegenüber Veränderungen der Quellparameter und zeigte, dass durch zusätzliche Selektivität des untersuchten MS3-Modus bei dieser Fragestellung keine Steigerung der Empfindlichkeit möglich ist. Ein weiterer Ansatzpunkt beschäftigte sich mit den Aspekten der manuellen Probenvorbereitung, dabei zeigen die Vorversuche mit selektiven MIP-Kartuschen zur Aufreinigung eine gute Abtrennung der Störkomponenten und ein verbessertes Analytsignal und somit einen vielversprechender Ansatz für weitere Untersuchungen. Die Entwicklung eines geeigneten Anreicherungsschritts mittels online-SPE resultierte im Einsatz von CN-Kartuschen und einer Abtrennung von Störkomponenten durch einen Waschschritt mit 5%iger Acetonitrillösung, da ein guter Kompromiss aus Signalsteigerung des kritischen Parameters EE2 (höchste Anforderungen) und Analytverlust (E1) erzielt werden konnte. Eine Charakterisierung der entwickelten Methode resultierte in einer guten Methodenperformance und einer außerordentlichen Empfindlichkeit in Realproben, wodurch die geforderten Nachweisgrenzen der Beobachtungsliste für Oberflächengewässer und E1 und E2 im Kläranlagenablauf erreicht werden können. Lediglich im Kläranlagenablauf wird die Nachweisgrenze für EE2 durch die starke Matrixbelastung nicht erreicht.

and testicular cancer in humans. Hence E1, E2 and EE2 are currently listed on the watch list complementing the Water Framework Directive (European Parliament and Council 2000/60/EG) with limits of detection at pg/L-levels (400 pg/L E1 and E2, 35 pg/L EE2), being a challenge for current analytical methods. Therefore the objective of this thesis is the development of a sensitive online-SPE-LC-MS/MS method for the analysis of E1, E2 and EE2 in surface and waste waters. Effluents from waste water treatment plants in Duisburg as well as surface waters from the river Rhine were used as representative real samples. One part of this thesis focused on the development and improvement of a suitable separation and detection method, where mobile phase additives, chromatographic columns, gradient elution and MS parameter were evaluated. As mobile phase additive ammoniumfluoride showed the most effective signal enhancement up to 800%, due to its [M-F]- adduct formation and dissociation to [M-H]- in the gasphase. When choosing an ideal separation column a few criteria such as a suitable separation of the observed estrogens and the matrixpeak interferences and removal of coeluting matrix were taken into account. A Restek Raptor Biphenyl column showed an ideal behaviour, considering the required criteria and was used as separation column in the developed method. The analysis of environmental samples, especially waste water, usually suffers from major matrix based signal suppression, which can be reduced by increasing selectivity. Consequently MS3 experiments with better selectivity were conducted, but did not show any benefit in signal to noise ratio. Higher selectivity can also be generated by an additional clean up step with MIP cartridges during manual sample preparation, where effective removal of matrix interferences and a better signal intensity was observed, contributing to further investigation of MIP cartridges. For analyte enrichment an additional online SPE step was introduced using CN-cartridges and a washing procedure with 5% acetonitrile. A good compromise between reduced recovery for E1 and signal enhancement for the critical parameter EE2 (highest requirements) could be observed. Method validation showed good method performance in linearity, reproducibility and an exceptional sensitivity with limits of detections meeting the watch list requirements for surface waters and E1 and E2 in waste water samples. Only the limit of detection for EE2 is not reached because of high matrix load in effluents of waste water treatment plants.