Anthochlor biosynthesis and its application in biotechnological breeding for novel flower color

Abstract

Anthochlor pigments are a group of secondary plant metabolites that, together with carotenoids and some flavonoids, produce yellow flower colour. Both, chalcones and aurones are collectively known as anthochlor pigments and serve as UV nectar guides in some plants. Especially Asteraceae accumulate two types of anthochlor pigments: on the one hand, the hydroxy types of chalcones and aurones, and on the other hand the deoxy types of chalcones and their corresponding aurones. Both types differ only in the presence or absence of a hydroxyl group in the 6’ position of the B-ring (chalcones) or the 4 position of the A-ring (aurones). Thus, hydroxychalcones do not readily accumulate in plants due to quick izomerization. Hence, our strategies in establishing yellow colouration involve the introduction of genes encoding proteins that lead to the accumulation of deoxy type anthochlors. Three chapters make up this thesis: 1.) The biochemical basis of pigmentation of different coloured Bidens ferulifolia cultivars was unravelled. The main aspects were the pigment composition and enzyme activity assays of involved proteins. The prevalent pigment in yellow cultivars was the 6’-deoxychalcone okanin and its derivates, whereas red cultivars accumulated cyanidin. Furthermore, we concluded that missing FHT and/or DFR activity created a bottleneck in anthocyanin biosynthesis. This aspect may be highly interesting for breeders of Bidens ferulifolia. 2.) Genetic and biochemical analysis of the bicoloured white-yellow Dahlia variabilis ‘Seattle’. From three putative CHRs, none were differentially expressed. Additionally, a strong difference in CHS2 expression between yellow and white petal parts may explain the bicolouration. Nonetheless, the transcriptomes that were built during the work can form the basis for further research and consolidate Dahlia variabilis ‘Seattle’ as a model plant for anthochlor research. 3.) Within this thesis, genes involved in anthochlor biosynthesis, derived from different members of the Asteraceae species, were cloned in large multigene constructs, utilizing the GoldenBraid vector system. These multigene constructs were introduced in model and target plants via transient and stable transformation, utilizing different transformation methods. We successfully created yellow petals with transient expression of a legume CHR and a glycosyltransferase in petals of Pelargonium zonale. Though the presence of transcripts was confirmed, HPLC analysis did not show traces of the expected 6’deoxychalcone isoliquiritigenin. Stable transformation of Pelargonium zonale and Petunia hybrida struggled with problems during regeneration. Only few regenerants that lacked a stable integration of the transgenes could be obtained. Other approaches to elucidate the contribution of the single genes of the anthochlor pathway included the design of constructs of the novel CRISPR/Cas9 system and virus-induced gene silencing (VIGS) methods, with the same results as the stable integration of genes.

Die Anthochloren Pigmente sind eine Gruppe sekundärer Pflanzenmetabolite und tragen gemeinsam mit Carotenoiden und einigen Flavonoiden zur gelben Blütenfärbung bei. Chalcone und Aurone gemeinsam bilden hierbei die Klasse der Anthochlore und dienen als Blütenmal für UV-sensitive Insekten. Insbesondere Asteraceen, akkumulieren zwei Typen an Anthochloren. Zum einen die Hydroxy-Typen von Chalconen und Auronen, zum anderen die Deoxy-Typen von Chalconen und Auronen. Beide Typen unterscheiden sich lediglich im Vorhandensein einer Hydroxy-Gruppe an der Position 6‘ des B-Rings (Chalcone), bzw. an der Position 4 des A-Rings bei Auronen. Hydroxychalcone akkumulieren sich nicht in Pflanzen, da sie schnell isomerisieren. Daher entschieden wir uns für eine Strategie zur Schaffung gelber Blütenfarben, Gene einzuführen, welche Proteine kodieren, die an der Synthese von Anthochloren des Deoxytyps beteiligt sind.Die Arbeit umfasst drei große Themenbereiche: 1.) Die biochemische Basis der Pigmentation verschieden farbiger Kultivare von Bidens ferulifolia wurde untersucht. Der Fokus hierbei lag auf der Ergründung der Pigmentkomposition wie auch der Untersuchungen der Aktivität beteiligter Enzyme. Die vorherrschenden Pigmente waren in den gelben Kultivaren 6‘-Deoxychalcone, in roten Blütenteilen Cyanidin. Desweiteren wurde festgestellt, dass teilweise fehlende FHT und/oder DFR Aktivität zu einem Flaschenhals der Anthocyanbiosynthese führte. Dieser Aspekt kann sich als höchst interessant für Bidens-Züchter erweisen. 2.) Genetische und biochemische Analysen der zweifarbigen, weiß-gelben Dahlia variabilis ‚Seattle‘.Eine Erklärung für die Zweifarbigkeit fand sich unter anderem in einer stark reduzierten Expression von CHS2. Nichtsdestotrotz bilden die im Rahmen der Arbeit gebildeteten Transkriptome eine gute Basis für weitere Untersuchung und sprechen für die Verwendung der Dahlia variabilis ‚Seattle‘ als Modellpflanze für die Forschung an Anthochloren. 3.) Im Rahmen dieser Arbeit wurden Gene, die an der Synthese von Anthochloren des Deoxytyps beteiligt sind, aus diversen Mitgliedern der Asteraceen-Familie isoliert und in große Multigen-Konstrukte des GoldenBraid-Systems geklont. Diese Multigen-Konstrukte wurden mittels verschiedener Transformationsmethoden sowohl stabil als auch transient in verschiedenen Ziel- und Modellpflanzen eingebracht. Die daraus resultierenden Pflanzen wurden sowohl auf RNA-, DNA- und Metabolit-Ebene auf das Vorhandensein der Gene und ihrer Produkte untersucht. Es gelang die Erschaffung von einzelnen gelben Petalen bei der transienten Expression von CHR mit einer Glykosyltransferase in Pelargonium zonale. Obwohl Transkripte durch PCR bestätigt wurden, zeigten HPLC Untersuchungen jedoch keinerlei Vorhandensein von dem zu erwarteten Pigment Isoliquiritigenin. Die stabile Transformation von Pelargonium zonale und Petunia hybrida führte zu nur wenige Stecklingen, welche jedoch keinen stabilen Einbau der Transgene aufwiesen.