Characterization of HAX1, a long noncoding RNA in Trichoderma reesei

Abstract

Trichoderma reesei is a filamentous fungus colonizing dead plant material such as rotting wood in its natural environment. Due to this saprophytic life style, it secretes large quantities of enzymes for the degradation of complex plant polysaccharides, i.e. cellulases and hemicellulases. In industry, T. reesei is widely applied for the production of those enzymes as they are commonly used for various manufacturing processes. Thus several attempts on the improvement of cellulase production in T. reesei have been made and several hypercellulolytic strains are available. The expression of cellulase and hemicellulase encoding genes is tightly controlled by a set of regulatory proteins. The most important ones are the Carbon catabolite repressor 1 (Cre1) and the major transactivator Xylanase regulator 1 (Xyr1). Several other factors acting on the regulation of this metabolic pathway have been described. However, all of them are transcription factors. Long noncoding RNAs (lncRNAs) emerged as common players in the epigeneticand transcription regulation in eukaryotes. They are ribonucleic acids of >200 nucleotides in length which, compared to transcription factors, can act as regulatory RNAs directly without being translated into proteins. Several examples of lncRNAs are known in human or mammals, but also in other eukaryotes such as yeast. However, to date no lncRNA has been described in a higher fungus. In this thesis, the first lncRNA discovered in a filamentous fungus, namely in T. reesei, is presented. Coincidentally, it was identified in the slight cellulase overproduction strain QM9414 by random integration of a marker cassette into the genome. Some of the resulting mutant strains showed a certain phenotype, i.e. a reduction in cellulase expression. Genetic analysis revealed that surprisingly in all those strains the marker cassette was integrated at the same locus. It is a non-annotated intergenic region. Due to the cellulase-depleted phenotype resulting from disruption of the DNA sequence, this locus was supposed to encode a factor acting as an activator of cellulase expression. Further investigations identified this factor as a lncRNA, which was termed HAX1 (Hypothetical activator of Xyr1). Various studies on the characterization of HAX1 were performed. Remarkably, strain specific effects regarding the production and function of this lncRNA were uncovered. RACE analysis revealed that different versions of HAX1 varying in terms of RNA length are produced in different T. reesei strains. The major version of HAX1 identified in QM9414 is longer than the dominating version in the wild-type strain QM6a, however the overall longest versions of HAX1 are present in the high-yield cellulase producing strain Rut-C30. From these results, a correlation between HAX1 length and the cellulase producing capacity of the different strains is obvious. A causal relationship was tested by overexpression of the major hax1 versions identified in the different strains. This resulted in an increase in cellulase activity, depending on RNA length. Therefore, finally evidence for the regulatory role of HAX1 as an activator of cellulase expression could be provided and different regulatory impacts of the different HAX1 versions could be verified. Besides the discovery of HAX1 and its characterization, the regulatory mechanism of this lncRNA was a target of investigation. A cluster of classical Xyr1-binding sites (XBS) in the HAX1 sequence allows a physical interaction of this lncRNA and the key-regulator Xyr1. This complex formation provides the basis for a sophisticated regulatory interplay of the two factors. Studies included in this thesis unveiled a negative feedback regulatory loop of Xyr1. Preferentially Xyr1 binds to the classical XBS at the upstream regulatory regions of cellulase and hemicellulase encoding genes. However, the presented data suggest that it also recognizes another, thus far unknown DNA-motive at the xyr1 promoter, which is bound with a lower affinity. This way, Xyr1 is capable of down-regulating its own expression when high amounts of the protein have been produced and classical XBS are saturated. Due to the complex formation with Xyr1, HAX1 interferes with this autoregulatory loop of Xyr1, thus finally resulting in an activation of cellulase expression. Summed up, comprehensive studies on the features and function of the lncRNA HAX1 are included in this thesis. In addition, a broad overview about lncRNAs in yeast and higher fungi is provided in the last chapter. This finally allows the reflection of the newly identified regulatory factor in comparison to other fungal lncRNAs.

Trichoderma reesei ist ein filamentöser Pilz der in seiner natürlichen Umgebung abgestorbene pflanzliche Materialien wie verrottendes Holz besiedelt. Aufgrund seiner saptotrophen Lebensweise sondert er große Mengen an Enzymen (Cellulasen und Hemicellulasen) für die Zersetzung komplexer pflanzlicher Mehrfachzucker ab. Insbesondere Cellulasen finden Anwendung in unterschiedlichen industriellen Herstellungsprozessen im humanen Bereich. Daher wird T. reesei standardmäßig für die Produktion dieser Enzyme im großen Rahmen eingesetzt. Für die industrielle Nutzung von T. reesei, wurden zahlreiche Versuche zur Optimierung der Cellulaseproduktion unternommen und viele hypercellulolytische Stämme sind verfügbar. Die Expression Cellulaseund Hemicellulase codierender Gene wird durch eine Vielzahl regulatorischer Proteine streng kontrolliert. Die wichtigsten unter ihnen sind das Katabolit-Repressor-Protein Cre1 und der Haupt-Transaktivator Xyr1. Einige andere Faktoren die auf die Regulation dieser Stoffwechselwege wirken sind bekannt. Allerdings handelt es sich bei allen, wie auch Cre1 und Xyr1, um Transkriptionsfaktoren. Lange nicht-codierende RNAs (lncRNAs) wurden als allgemein gebräuchliche Mitwirker in epigenetischer und transkriptioneller Regulation in Eukaryoten erkannt. Bei lncRNAs handelt es sich um Ribonukleinsäuren die mehr als 200 Nukleotide lang sind und, im Vergleich zu Transkriptionsfaktoren, nicht in Proteine übersetzt werden, sondern direkt als regulatorische RNAs wirken. Zahlreiche Beispiele in Menschen und Säugetieren, aber auch in anderen Eukaryoten wie Hefe sind bekannt. Bis zum heutigen Tage jedoch, wurde keine lncRNA in einem höheren Pilz beschrieben. In dieser Doktorarbeit wird die erste lncRNA in einem filamentösen Pilz, nämlich in T. reesei, beschrieben. Sie wurde zufällig durch das ungerichtete Einbringen einer Marker-Kassette in das Genom des schwachen Cellulase Überproduktionsstammes QM9414 entdeckt. Einige der aus der Transformation resultierenden Mutantenstämme zeichneten sich durch eine reduzierte Cellualseproduktion aus. Genetische Untersuchungen ergaben, dass überraschenderweise bei allen Stämmen die Marker-Kassette am selben Lokus integriert war. Bei dem Lokus handelt es sich um eine bisher nicht verzeichnete, zwischen zwei Genen liegende Region. Aufgrund des Cellulase-reduzierten Phänotyps der sich aus der Unterbrechung der DNA-Sequenz ergibt, wurde angenommen dass dieser Lokus für einen Aktivator der Cellulaseproduktion codiert. Im Verlauf weiterer Untersuchungen stellte sich heraus, dass es sich bei diesem Faktor um eine lncRNA handelt. Diese lncRNA erhielt den Namen HAX1 (Hypothetischer Aktivator von Xyr1). Zahlreiche Untersuchungen zur Charakterisierung von HAX1 wurden durchgeführt. Erstaunlicherweise wurden stammspezifische Unterschiede hinsichtllich der Produktion und Funktion dieser lncRNA aufgedeckt. Aus einer RACE Analyse ergab sich, dass RNAs unterschiedlicher länge in verschiedenen T. reesei Stämmen vorliegen. Die Hauptform von HAX1 in QM9414 ist länger als die dominierende Version im Wildtyp-Stamm QM6a. Die generell längsten Varianten jedoch finden sich im hoch-effizienten Cellulase-Produzenten und industriellen Vorläuferstamm Rut-C30. Aus diesen Ergebnissen erschließt sich eine Korrelation zwischen der Länge von HAX1 und der Leistungsfähigkeit bezüglich der Cellulase-herstellung. Ein kausaler Zusammenhang wurde durch die Überexpression der jeweiligen Hauptvarianten von HAX1 in den verschiedenen Stämmen belegt. Dies führte zu einer Erhöhung der Cellulaseaktivität mit unterschiedlichen Ausprägungen, je nach Länge der überexprimierten lncRNA. Schlussendlich konnte somit sowohl ein genereller Beweis für den regulatorischen Einfluss von HAX1, als auch für die Bedeutung der Herstellung von Versionen unterschiedlicher Länge erbracht werden. Zudem wurde der regulatorische Mechanismus von HAX1 genauer untersucht. Die HAX1-Sequenz enthält eine Ansammlung klassischer Bindungsstellen für Xyr1 (XBS), welche eine Interaktion der lncRNA und des Schlüsselregulators Xyr1 ermöglichen. Die RNA-Protein-Komplexbildung liefert die Grundlage für ein ausgeklügeltes regulatorisches Zusammenwirken der beiden Faktoren. Studien in dieser Doktorarbeit enthüllen eine negative regulatorische Schleife hinsichtlich der Xyr1 Produktion. In erster Linie bindet Xyr1 an die klassischen Bindungsstellen in den regulatorischen Bereichen der Cellulaseund Hemicellulase codierenden Gene. Die vorliegenden Daten zeigen jedoch, dass Xyr1 mit geringerer Affinität auch an ein bisher unbekanntes DNA-Motiv am Xyr1 Promotor bindet. Dies ermöglicht Xyr1 seine eigene Expression herunterzuregulieren wenn bereits größere Mengen des Proteins vorhanden, und alle XBS abgesättigt sind. Durch die Komplexbildung mit Xyr1 greift HAX1 in die Autoregulation von Xyr1 ein und bewirkt somit schlussendlich eine Erhöhung der Cellulaseproduktion. Insgesamt werden umfassende Studien betreffend der Eigenschaften und Funktion der lncRNA HAX1 in dieser Doktorarbeit vorgestellt. Darüberhinaus bietet das letzte Kapitel einen umfangreichen Überblick über lncRNAs in Pilzen im Allgemeinen. Dies ermöglicht abschließend eine Betrachtung der neu entdeckten lncRNA HAX1 im Vergleich zu anderen lncRNAs in Pilzen.