Enzymes in medical applications: investigating the enzyme horseradish peroxidase

Abstract

Im Zentrum dieser Diplomarbeit stand das Pflanzenenzym Meerrettich-Peroxidase (MRP) sowie dessen Verwendungen in der medizinischen Diagnostik und gezielten Krebs Therapie. Aktuell wird dieses Enzym aus der Pflanze extrahiert, allerdings erhält man nur geringe Ausbeuten sowie eine Mischung aus verschiedenen Isoenzymen mit unterschiedlichen biochemischen Eigenschaften. Dies ist aber widersprüchlich zu Quality by Design sowie FDA Richtlinien. Ein weiterer Nachteil liegt in der pflanzlichen Glykosylierung des Enzyms, welche zu einem raschen Abbau im menschlichen Körper führt. Das Ziel dieser Arbeit war die rekombinante Produktion, Reinigung und Charakterisierung eines maßgeschneiderten MRP Enzyms. Da dies eine sehr vielfältige Aufgabe war, wurde die Diplomarbeit in drei Teile aufgeteilt. 1. Bis jetzt wurde ein Großteil der Studien nur am MRP Isoenzym C1A durchgeführt. Wir produzierten daher 18 neuartige MRP Isoenzyme rekombinant, charakterisierten diese und versuchten eine vorhandene Reinigungsstrategie zu optimieren. Es war möglich neue potentielle Kandidaten für spezifische Diagnose Kits zu finden und die Reinigungsstrategie zu optimieren. 2. Um die von Hefen durchgeführte Hypermannosylierung von Glykoproteinen in den Griff zu bekommen, wurde ein Glycoengineering Ansatz getestet. Hierfür wurden alle 8 N-Glykosylierungsstellen der MRP C1A einzeln mutiert und jeweils die am besten geeignetste Mutation ermittelt. Anschließend wurden alle 8 Stellen mutiert, um MRP C1A ohne N-Glykosylierung herzustellen. Obwohl dieser Mutant kaum katalytische Aktivität zeigte, stellt das Gesamtergebnis eine solide Basis für zukünftige Enzymmodifikationen dar. 3. Das dritte Projekt befasste sich mit der Herstellung von MRP in einem modifizierten P. pastoris Stamm. Hierfür wurde die Mannosyltransferase OCH1, welche Hypermannosylierung initiiert, inaktiviert. Obwohl dieser Stamm sehr schwer zu kultivieren war und einen im Wachstum gehemmten Phänotyp zeigte, war es möglich, ein homogener glykosyliertes Protein zu erzeugen

This diploma thesis focuses on the plant enzyme horseradish peroxidase (HRP) and its application in medical diagnostics and targeted cancer treatment. Currently, HRP is isolated from plant, resulting in low yields and a mixture of different HRP isoenzymes with varying biochemical properties as final enzyme preparation. This strongly contradicts Quality by Design guidelines and FDA regulations. Another major drawback lies in the foreign glycosylation of the plant enzyme leading to a rapid clearance from the human body. The objective of the present work was the recombinant production, purification and characterization of a specifically tailored HRP enzyme. Because this was a rather versatile task, the thesis was divided into three parts. 1. Until now, the majority of studies only dealt with isoenzyme HRP C1A. Therefore, we recombinantly produced 18 novel HRP isoenzymes and performed subsequent biochemical characterization as well as an optimization of the existing downstream procedure for hyperglycosylated HRP derived from yeast. We were able to identify potential candidates for specific diagnostic applications and to optimize the present downstream procedure. 2. In order to handle the tendency of yeasts for hypermannosylating glyco-proteins we tested a glycoengineering approach. Thus, all 8 N-glycosylation sites of HRP C1A were mutated and the most suitable mutation was determined. Afterwards we combined the 8 most promising mutations in order to produce active HRP C1A without N glycosylation. Although this mutant hardly showed catalytic activity the overall outcome described a useful basis for further enzyme engineering approaches. 3. The third project dealt with the production of HRP in a modified P. pastoris strain. Therefore, the mannosyltransferase OCH1, which triggers hyper-mannosylation, was knocked out. Although this strain was hard to cultivate and showed a growth-impaired phenotype, more homogeneously glycosylated protein could be produced at an adequate production rate.