Entwicklung und Validierung von Analysenverfahren zur Detektion von endokrin aktiven Substanzen in Lebensmittelkontaktmaterialien

Abstract

Zur Untersuchung von Lebensmittelkontaktmaterialien auf endokrine Aktivität wurden Analysenverfahren entwickelt und validiert, mit denen die Östrogen- und Androgenaktivität von unterschiedlichen Lebensmittelkontaktmaterialien aus Kunststoff, Papier und beschichteten Metallen bestimmt werden können. Eine Kombination aus Migrationsversuchen in Anlehnung an die VO (EU) 10/2011 und einer Festphasenextraktion erwies sich als geeignete Probenvorbereitungsmethode mit zufriedenstellenden Wiederfindungsraten und Reproduzierbarkeiten für unterschiedliche endokrin aktive Substanzen. Zur Bestimmung der endokrinen Aktivität wurden Reportergenassays auf Basis von Hefezellen (YES und YAS) und Humanzellen (ER-und AR-CALUX), sowie der Proliferationsassay E-Screen verwendet. Im Rahmen einer Validierung erwiesen sich alle vier Reportergenassays als robuste Prüfmethoden, die für die quantitative Analyse der endokrinen Aktivität von Lebensmittelkontaktmaterialien geeignet sind. Der Einfluss der Probenmatrix wurde allerdings als ein kritischer Faktor identifiziert und musste für jede einzelne Probe durch die Analyse von dotierten Extrakten abgeklärt werden. Der Proliferationsassay E-Screen erwies sich für eine Quantifizierung der Östrogenaktivität von Lebensmittelkontaktmaterialien hingegen als wenig geeignet und konnte daher nur semi-quantitativ ausgewertet werden. Bei der Untersuchung von Lebensmittelkontaktmaterialien auf Östrogen- und Androgenaktivität konnte ein hohes Maß an Übereinstimmung zwischen den unterschiedlichen Bioassays beobachtet werden. 15 von 105 untersuchten Proben zeigten eine messbare Östrogen-Aktivität im YES mit Aktivitäten im Bereich von 0,6 bis 59 ng/L Estradiol-Äquivalenten (EEQ). Vier weitere Proben zeigten nur im etwas sensitiveren ER-CALUX eine Östrogenaktivität. Androgenaktivitäten konnten in keiner der untersuchten Proben nachgewiesen werden. Bei der Analyse auf Antagonisten wurden hingegen signifikante Unterschiede zwischen den Testsystemen beobachtet. Mit YES und YAS zeigten viele Proben eine starke antagonistische Aktivität, die mit den auf Humanzellen basierenden Bioassays nicht bestätigt werden konnte.

The aim of the present work was to develop and validate test methods for the determination of estrogen and androgen active substances in food contact materials. A combination of migration according to EU 10/2011 and a concentration step by solid phase extraction proved to be a suitable sample preparation method with a high sensitivity and sufficient recovery rates and reproducibility for different endocrine active substances. In vitro estrogen and androgen responsive reporter gene assays based on yeast cells (YES and YAS) or human osteoblast cells (ER- and AR-CALUX) and the proliferation assay E-Screen were used to analyse packaging for endocrine active substances. Validation showed that all four reporter gene assays are suitable for the quantitative analysis of endocrine activity in food contact materials. However, the influence of the sample matrix was identified as a critical factor and had to be tested for each sample by analyzing spiked extracts. The proliferation assay E-screen was not suitable for a proper quantification of estrogenic activity in food contact materials and could therefore only be evaluated semi-quantitatively. A high level of consistency between the different bioassays could be observed by screening for estrogen and androgen agonists. 15 out of 105 tested samples showed a measurable estrogen activity in the YES, with activities ranging from 0,6 to 59 ng/L Estradiol equivalents (EEQ). Four additional samples showed an estrogen activity in the more sensitive ER-CALUX Androgen agonists could not be detected in any of the tested samples, neither with YAS nor with AR CALUX When testing for antagonists, significant differences between yeast and human cell-based bioassays were observed. Using YES and YAS many samples showed a strong antagonistic activity that could not be verified using the human cell-based CALUX® assays or the E-Screen.