Characterization of the endocrine activity of food contact materials by human cell bioassays (Erα, AR, TRβ and PPARγ CALUX) and chromatographic analysis (GC-MS/FID, HPLC-MS3)

Abstract

Endokrin wirksame Substanzen zeigen strukturelle Ähnlichkeiten zu natürlichen Hormonen und stehen im Verdacht das menschliche Hormonsystem durch Induktion hormonabhängiger Effekte zu beeinflussen. Zahlreiche wissenschaftliche Studien lassen vermuten, dass endokrin aktive Substanzen aus Verpackungen unterschiedlicher Materialen ins Lebensmittel übergehen. Jedoch konnten in den meisten Untersuchungen die hormonaktiven Chemikalien nicht identifiziert werden und die Quelle der Hormonaktivität blieb somit unklar.Um dieser Fragestellung nachzugehen wurde im Rahmen dieser Dissertation die endokrine Belastung von Lebensmittelverpackungen mittels Humanzellen-Bioassays (CALUX®) in Kombination mit chemischer Spurenanalytik (GC-MS/FID, HPLC-MS3) erfasst. Lebensmittelverpackungen wurden dazu gemäß EU Richtlinie 10/2011 mit Lebensmittelsimulantien migriert und diese über Festphasenextraktion aufkonzentriert. Die Verpackungsextrakte wurden anschließend mittels Bioassays auf Östrogen-, Androgen-, und Schilddrüsenhormonaktivität bzw. Substanzen die über PPA-Rezeptoren den Fettsäurestoffwechsel beeinflussen können, analysiert. Zusätzlich erfolgte eine chemische Spurenanalyse mittels GC-MS/FID und HPLC-MS3 um potentielle hormonaktive Substanzen zu identifizieren. Eine GC-MS Screeningmethode für 33 bekannt bzw. potentiell endokrin aktive Substanzen wurde entwickelt und validiert. Für die Identifizierung von unbekannten Chemikalien wurde ein Datenbankvergleich der Massenspektren unter Verwendung der NIST02 Bibliothek realisiert.Ein Großteil der positiv getesteten Proben war östrogenaktiv, wobei auch einzelne Migrate eine Antiandrogenaktivität oder auch eine Aktivität im PPARγ CALUX® aufwiesen. Keine der untersuchten Proben zeigte hingegen eine Schilddrüsenhormonaktivität. Neben für den Lebensmittelkontakt zugelassenen Substanzen, die bewusst in Verpackungen eingesetzt werden, wurden auch Masterbatch-Verunreinigungen, Nebenprodukte aus komplexen Polymerisationsreaktionen oder Abbauprodukte von Antioxidantien mittels GC-MS und HPLC-MS3 identifiziert. In einigen Fällen konnte eine Korrelation zwischen den im Bioassay detektierten Hormonaktivitäten und den chemisch identifizierten Substanzen hergestellt werden, wobei die Quelle der Hormonaktivität auch oft unklar blieb. Ohne Kenntnis der tatsächlichen chemischen Substanz, lässt sich aus einer in vitro Hormonaktivität jedoch keine ernsthafte Risikobewertung für die menschliche Gesundheit ableiten.

Endocrine active substances show structural similarities to natural hormones and are suspected to affect the human endocrine system by inducing hormone dependent effects. Food packaging of different materials were tested positive for endocrine activity in various studies. However, in most cases the source of hormone activity could not be identified.In order to address this issue, a combination of validated human osteoblast cell bioassays (CALUX®) and chemical trace analysis methods via GC-MS/FID and HPLC-MS3 for the identification of hormone active substances in food contact materials was established. Food packaging of different materials were migrated by food simulants according to EU 10/2011 with worst case scenarios being used. Further, migrates were concentrated by solid phase extraction and then analysed via CALUX® bioassays for estrogen, androgen, thyroid hormone and PPARγ agonists and antagonists. Additionally, chemical trace analysis by GC-MS/FID and HPLC-MS3 was used to identify potential hormone active substances in sample migrates. A GC-MS method to screen migrates for 33 known or potential endocrine active substances was established and validated. Further, the identification of unknown compounds was achieved by database comparison to known mass spectra using a NIST02 library.Most of the positive tested samples were estrogen active, whereas a few migrates also showed an antiandrogen activity or agonistic effects in the PPARγ CALUX®. None of the analysed samples did cause any thyroid hormone activity. Besides substances approved for food contact use many non-intentionally added substances (NIAS), which include master batch impurities, side products from complex polymerization reactions or breakdown products from antioxidants, were identified in food packaging by GC-MS/FID and HPLC-MS3. In some cases the detected hormone activities were correlated to the identified endocrine active chemicals, whereas often the source of activity remained unclear. However, without knowledge of the actual substances causing the in vitro hormone activity no serious risk assessment for human health is possible.