Development of a platform methodology to purify recombinant glycoproteins from yeast

Abstract

Pichia pastoris ist ein etablierter Expressionsstamm, der in der Massenproduktion von vielfältigen Proteinen Einsatz findet. Da die Mehrheit der produzierten Proteine glykosyliert ist, können gängige Downstream-Technologien nicht genutzt werden um das gewünschte Zielprotein zu aufzureinigen. Das Ziel dieser Thesis ist die Entwicklung und Etablierung effizienter Aufreinigungsmethoden basierend auf der Monolithtechnologie für rekombinante Proteine mit verschiedenen Glykolysierungsgraden produziert durch P. pastoris. Meerrettich Peroxidase (HRP) ist gut untersuchtes Enzym, das beispielsweise in der medizinischen Diagnostik oder gekoppelten Enzymassays Anwendung findet. In dieser Thesis wurde es als Modellprotein ausgewählt. Vorhergehende Studien zur Aufreinigung von HRP mittels einer hydrophoben Ladungsinduktionschromatographie (HCIC) auf Gel Basis und einer Anionaustauschchromatographie (AEX) auf Basis eines Monolithen zeigten befriedigende Resultate im Durchlauf Modus. Monolithe in der Chromatographie übertreffen die üblichen Partikel basierenden Gele in vielerlei Hinsicht, da sie nicht durch Diffusion limitiert sind. Deshalb basierte das entwickelte DSP Protokoll lediglich auf Monolithen: eine hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC), die den HCIC Schritt ersetzt, und eine AEX. Drei HRP Isoenzyme mit unterschiedlicher Anzahl an N-Glykosylierungsketten werden genutzt um zunächst optimale Prozessparameter zu erforschen und anschließend das gesamte, entwickelte DSP Protokoll zu testen. Da genetische Mutagenese wenig Einfluss auf die Vielfalt der kontaminierenden Proteine hat, wurde ein einheitliches Protokoll für die drei Enzyme vorgeschlagen. Das DSP Protokoll in 2 Schritten wurde an Erntebrühe aus kontrollierten Bedingungen (Bioreaktor) und an Erntebrühe aus unkontrollierten Bedingungen (Schüttelkolben) getestet. Dies zeigte, dass die Upstream Variationen einen großen Einfluss auf den Aufreinigungserfolg hatte. Das Produkt wurde bis zu handelsüblicher Qualität aufgereinigt, wobei das DSP Protokoll weiterhin optimiert werden muss, sodass eine gleichbleibende Qualität durch das DSP unabhängig vom USP gewährleistet wird.

Pichia pastoris is a well-established expression host used for large scale production of various proteins. Majority of its produced proteins is glycosylated making it hard to use common downstream processes (DSP) to obtain purified target products. The goal of this thesis was to develop efficient purification protocols based on monolith technology for recombinant proteins with varying degree of glycosylation produced in the yeast P. pastoris. Horseradish peroxidase (HRP) is a well-studied enzyme with many diverse applications such as medical diagnostics and coupled enzyme assays and is used as the model protein in this thesis. Preliminary studies with HRP on a particle based hydrophobic charge induction chromatography (HCIC) column and a monolithic anion exchange chromatography (AEX) column showed satisfying results in flowthrough mode. In chromatography, monoliths outperform particle based resins in terms of mass transfer properties since they are not limited in diffusion. Thus, the developed DSP protocol based on solely monolithic chromatography steps: an AEX step and a hydrophobic interaction chromatography (HIC) step, which substituted HCIC from preliminary studies. Three HRP isoenzymes with varying degree of glycosylation were used to screen for optimal conditions on small scale monoliths and to test the developed two step flowthrough protocol. Since genetic mutagenesis had a minor impact on the variety of contaminant proteins, a joint protocol was suggested for the three tested HRP isoenzymes. The two step protocol was tested on broth from controlled conditions (bioreactor) and from uncontrolled conditions (shake flask) showing a high influence of USP variations on DSP performance. Purification up to commercial standard was achieved although the protocol needs to be developed further to achieve stable quality with any USP mode.