Production, physical-chemical properties and biological activity of fungal surface-active proteins for industrial applications

Abstract

Hydrophobine sind oberflächenaktive Proteine aus filamentösen Pilzen. Obwohl sich Hydrophobine in ihrer Aminosäurensequenz stark unterscheiden, weisen sie bestimmte strukturelle Gemeinsamkeiten auf. Sie bestehen circa aus 100 Aminosäuren und enthalten immer acht konservierte Cysteine, die zu vier Disulfidbrücken verbunden sind. Diese Proteie weisen amphiphilen Charakter auf, d.h. sie haben eine hydrophobe (wasserabweisende) und eine hydrophile (wasserliebende) Oberfläche. Aufgrund dieser Struktur können sie sich an hydrophoben-hydrophilen Grenzflächen zwischen Feststoff und Flüssigkeit oder zwischen Flüssigkeit und Luft zu Proteinschichten organisieren. Diese Proteinschichten sind flexibel aber außergewöhnlich stabil und kehren die Polarität der benetzten Oberfläche um. Hydrophobe Oberflächen können hydrophil werden und umgekehrt. Pilze nutzen diese Funktion um ihre Sporen und Fruchtkörper wasserabweisend zu machen. Aufgrund ihrer außergewöhnlichen Eigenschaften besteht ein großes Interesse Hydrophobine in industriellen Anwendungen einzusetzen. Eine Möglichkeit ist zum Beispiel der Einsatz als Stabilisatoren von Emulsionen, zur Beschichtung von stark wasserabweisenden Flächen zur leichteren Bearbeitung oder als Fusionspartner zur Immobilisierung von Enzymen. Auch in der medizinischen Industrie finden Hydrophobine Verwendung. Beschichtete Implantate weisen eine höhere Resistenz gegen bakteriellen Befahl auf und beschichtete Nanopartikel können zur gezielten Verabreichung von Wirkstoffen verwendet werden. Die hohe Nachfrage nach Hydrophobinen verlangt nach einer wirtschaftlichen Herstellung der Proteine im industriellen Maßstab. In den vergangenen Jahren wurde an der rekombinanten Produktion der Hydrophobine in verschiedene Organismen gearbeitet. Aufgrund ihrer Eigenschaften ist solch eine Produktion allerdings schwer realisierbar. Jedes bislang getestet System (Bakterien, Hefe, filamentöser Pilz) besitzt spezifische Vor- und Nachteile. In der vorliegenden Dissertation wurden die Hydrophobine des filamentösen Pilzes Trichoderma untersucht. Dieser Pilz besitzt außergewöhnlich viele Gene dieses Proteins, welche neuen Eigenschaften aufweisen, die potentiell für spezifische Anwendungen wie die enzymatische Hydrolyse von Polyethylenterephthalat und für die Ummantelung von Mikropartikeln genutzt werden können. Es wurde ein Vergleich durchgeführt von verschiedenen Produktionstämmen: Escherichia coli, Pichia pastoris und Trichoderma reesei. Eine multivariante Analyse wurde angewendet um das optimale System zur Produktion von Hydrophobinen zu finden.

Hydrophobins are small secreted proteins from filamentous fungi. They play a role in fungal growth and development and in the interaction with their environment by possessing the unique property to self-assemble at hydrophobic-hydrophilic interfaces into ordered protein layers. Currently there is an intense interest in biotechnological and medical industry in hydrophobin-based applications. Therefore, the development of production technologies will be critical for future commercial use and success of hydrophobins. Because of the characteristic properties of hydrophobins (foam-inducing, surface-active), it is not a simple task to find the optimal production host and achieve high yields. In this doctoral thesis, hydrophobins of Trichoderma virens and their genetic regulation have been investigated in detail. Trichoderma species have an extended arsenal of hydrophobin genes and could be potentially exploited for specialized applications. Class II hydrophobins HFB4 and HFB7 from T. virens were then heterologously expressed in the closely related host and prominent cellulase producer Trichoderma reesei as well as in the bacterium Escherichia coli and the yeast Pichia pastoris. The mutant strains were cultivated in a bioreactor with 2 L working volume. The yields were compared and comprehensive functional and physical-chemical analyses of protein properties performed. The produced hydrophobins were tested in the coating of polylactid-co-glycolic acid (PLGA) microparticles for the use in drug delivery as well as enhancers in the enzymatic hydrolysis of polyethylene terephthalate. Moreover, a preliminary study was performed on the use of Trichoderma hydrophobins as immobilizers of industrially relevant enzymes.