Cellular mechanisms of regulation in trichoderma reesei

Abstract

Trichoderma reesei ist ein filamentöser Schlauchpilz, der ein enormes Potential für die Sekretion von Kohlenhydrat-aktiven Enzymen aufweist. Insbesondere seine Cellulasen und Xylanasen finden eine breite Anwendung in der Biotech-Industrie. Die Expression dieser Enzyme wird adaptiv durch Induktoren, die von lignocellulosischer Biomasse stammen, ausgelöst. Diese Induktoren fördern in weiterer Folge die Aktivierung oder Repression ihrer Zielgene mittels unterschiedlicher Regulatoren. Als erster Schritt innerhalb dieser Dissertation wurden potentielle neue Regulatoren, basierend auf ihrer spezifischen Hochregulation auf der induzierenden Kohlenstoffquelle Weizenstroh, darunter sieben Transkriptionsfaktoren und zwei GCN-verwandte N-Acetyltransferasen, identifiziert. Diese Gene (uws; englische Abkürzung für: upregulated on wheat straw) wurden deletiert und anschließend charakterisiert. Die Ergebnisse zeigen, dass sie am (Hemi)cellulose Abbau und der damit verbundenen Bildung von Cellulasen, Xylanasen und zusätzlichen Proteinen auf unterschiedlichen induzierenden Kohlenstoffquellen, darunter Lactose, Cellulose und Weizenstroh, beteiligt sind. Darüber hinaus tragen einige von ihnen zu einer erhöhten Stresstoleranz von T. reesei bei. Des Weiteren wurde die Funktion von T. reesei Transkriptionsfaktor ACE1, einem Repressor der (Hemi)cellulase Genexpression, untersucht, da es Hinweise darauf gibt, dass seine Bedeutung weit über seine etablierte Rolle hinausgeht. Es konnte gezeigt werden, dass die Deletion von ace1 zu einer starken Beeinträchtigung der Verwendung von natürlich vorkommenden Fünf- und Sechskohlenstoffpolyolen, darunter achirale Polyole und chirale Polyole in ihrer D-Konfiguration, führt. Der Verlust von ace1 führt zu Nichtaufnahme dieser Polyole und zu einer Herunterregulierung zahlreicher Gene, darunter ein großer Anteil an Transportern (TRA; englische Abkürzung für: transporters regulated by ACE1). Die Deletion der drei am stärksten herunterregulierten Transporter zeigt, dass TRA1 am Abbau von Xylitol und TRA3 an der Verwertung von Xylitol und Galactitol beteiligt sind. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass ACE1 auch in der Aufrechterhaltung der Zellwandintegrität eine wichtige Rolle spielt, da der dazugehörige Deletionsstamm eine erhöhte Sensitivität gegenüber dem Zellwand Stressor Calcofluor-Weiß aufweist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Resultate dieser Doktorarbeit zur Identifikation neuartiger molekularer Ziele führten, die in der Regulation von Kohlenhydrat-aktiven Enzymen eine wichtige Rolle spielen. Die gewonnen Erkenntnisse sind wertvoll für die industrielle Stammverbesserung und decken ein breites Spektrum ab, welches von der Leistungssteigerung bestehender Enzymcocktails bis hin zur Verbesserung der Stresstoleranz von T. reesei Fermentationsstämmen reicht. Darüber hinaus werfen die gewonnen Daten ein neues Licht auf die regulatorischen Ziele von ACE1 und zeigen so die divergente Evolution dieser Transkriptionsfaktorengruppe in der Pilzphysiologie.

Trichoderma reesei is a filamentous ascomycete that exhibits a tremendous potential regarding the secretion of carbohydrate-active enzymes. In particular, its cellulases and xylanases find wide application in the biotech industry. The expression of these enzymes is triggered adaptively by lignocellulosic biomass derived inducers, which promote the activation or repression of their target genes through different regulators. As a first step within this thesis, new candidate regulators including seven transcription factors and two GCN5-related N-acetyltransferases were identified based on their specific upregulation on the inducing C-source wheat straw. These genes being upregulated on wheat straw (uws) were deleted and subsequently characterized. Our results show that they are involved in (hemi)cellulose degradation, cellulases, xylanases and accessory enzyme formation on different inducing C-sources including lactose, cellulose and wheat straw. In addition, some of them contribute to an enhanced stress tolerance of T. reesei. Moreover, the function of T. reesei TF ACE1, a repressor of cellulase and hemicellulase gene expression, was further elucidated as there is evidence that its importance goes far beyond its established role. Deletion of ace1 led to a strong impairment in the utilization of naturally occurring five- and six-carbon polyols including achiral polyols and chiral polyols in their D-configuration which was the result of the inability to take them up. Loss of ace1 leads to the downregulation of numerous genes including a large set of transporters, thus named transporters regulated by ACE1 (TRA). Deletion of three of the most downregulated transporters shows that TRA1 is involved in the catabolism of xylitol, whereas TRA3 was found to be engaged in the utilization of xylitol and galactitol. Ace1 is also involved in cell wall integrity as its deletion shows sensitivity towards the cell-wall stressor calcofluor-white. In summary, the results provided within this thesis led to the identification of novel molecular targets being involved in the regulation of carbohydrate-active enzymes, thus being highly valuable for industrial strain improvement by reaching from increasing the performance of exisiting enzyme cocktails to the enhancement of stress tolerance of T. reesei strains used during fermentations. In addition, our data shed new light on the regulatory targets of ACE1 and thus demonstrate the divergent evolution of this TF group in fungal physiology.