Cytochrom P450 Enzyme stellen eine der größten und vielfältigsten Protein-Superfamilien dar und kommen in allen Lebensreichen vor. Die Enzyme sind verantwortlich für die Katalyse essentieller Reaktionen wie beispielsweise Kohlenstoff-Assimilierung, Hormon-Synthese, Aufbau von Strukturelementen, Karzinogenese oder Degradierung von Xenobiotika. Die Isolierung von Cytochrom P450 Enzyme aus natürlichem Pflanzen- oder Tiermaterial ist sehr mühsam und führt häufig nur zu geringen Ausbeuten, weshalb ihre rekombinante Produktion eine attraktive Alternative darstellt. Weil sie komplexe Kohlenstoffverbindungen, sehr spezifisch hydroxylieren können, ist die Produktion von Cytochrom P450 Enzymen äußert interessant für Biotransformation und industrielle Anwendungen. Außerdem ist die rekombinante Expression und nachfolgende Aufreinigung von Cytochrom P450 Enzymen eine hilfreiche Voraussetzung für Struktur- und Funktionsaufklärung. Häufig weisen Cytochrom P450 Enzyme nur 20 % Homologie auf, was Homologie-Modellierung für akkurate Strukturaufklärung erschwert, vor allem in den Substratbindungsregionen. Daher kann ihre Struktur nur nach Reinigung und Kristallisierung genau bestimmt werden. All das, zeigt deutlich, dass die rekombinante Produktion von Cytochrom P450 Enzymen sowohl für wissenschaftliche als auch industrielle Zwecke relevant und interessant ist. Die rekombinante Expression, im speziellen von eukaryotischen Cytochrom P450 Enzymen, birgt allerdings einige Herausforderungen, da sie (I) komplexe Co-Faktor Anforderungen haben, (II) in den meisten Fällen membran-gebunden sind und (III) auch Cytochrom P450 Reduktase benötigen um katalytisch aktiv zu sein. Im Zuge dieser Arbeit wurden Strategien für die rekombinante Expression und nachfolgende Reinigung einer Chalkon 3-Hydroxylase (CH3H), einem wenig erforschten membrangebundenen Cytochrom P450 Enzym aus Dahlia variabilis entwickelt. Unterschiedliche Proteinvarianten und Expressionssyteme, genauer Escherichia coli, Pichia pastoris und Saccharomyces cerevisiae wurden für die rekombinante Produktion der CH3H eingesetzt und untersucht. Es wurde nicht nur ihre Fähigkeit große CH3H Produkt-Mengen zu produzieren evaluiert, sondern außerdem auch neue, nachhaltigere Möglichkeiten der rekombinanten Proteinproduktion erforscht. Außerdem wurde eine Reinigungsstrategie für die membran-gebundene CH3H entwickelt, indem systematisch alle Reinigungsschritte untersucht und optimiert wurden. Dadurch wurde die biochemische Charakterisierung des Enzyms ermöglicht und potentiell eine Grundlage für die zukünftige Kristallisierung und Strukturaufklärung geschaffen. Das würde Aufschluss geben, über die Fähigkeit der CH3H Chalkone in Position 3 zu hydroxylieren. Darüber hinaus glauben wir, dass die im Zuge dieser Arbeit entwickelten Methoden für die Produktion und Reinigung der CH3H, zumindest teilweise, auch für die Produktion anderer Enzyme anwendbar sind, im speziellen für die Produktion anderer pflanzlicher Cytochrom P450 Enzyme. Diese sind bisher in der Cytochrom P450 Forschung stark vernachlässigt worden, obwohl sie eine der größten Gruppen repräsentieren. Die durchgeführten Studien könnten als Ausgangspunkt für weitere Erforschung von pflanzlichen Cytochrom P450 Enzymen dienen, die besonders aufgrund der Produktion von zahlreichen Sekundärmetaboliten interessant sind, welche gesundheitsfördernde Wirkungen aufweisen, wie beispielsweise antibakterielle, antivirale und antikanzerogene Eigenschaften.
Cytochrome P450s make up one of the largest and most diverse known protein superfamily and are present in all kingdoms of life. The enzymes are responsible for catalysis of essential reactions including carbon source assimilation, hormone-synthesis, generation of structural compounds, carcinogenesis and degradation of xenobiotics. Isolation of cytochrome P450s from native plant or animal tissues often results in humble yields, which is why recombinant production is a striking alternative. Due to their ability to hydroxylate complex hydrocarbons very specifically, production of high amounts of cytochrome P450s is of utmost interest concerning biotransformation and industrial applications. Secondly, recombinant expression and subsequent purification of cytochrome P450s is a precondition for structure-function elucidation. Often cytochrome P450s only share as little as 20 % homology, impeding homology modelling for accurate structural analysis, especially of substrate binding regions. Therefore, their structure can only be precisely examined upon purification and crystallization. All of this clearly indicates that recombinant production of cytochrome P450s is of great interest for academia as well as industry. However, recombinant expression, especially of eukaryotic cytochrome P450s entails various challenges as they (I) have complex co-factor requirements, (II) are usually membrane-bound and (III) require cytochrome P450 reductase for catalytic activity. Within this Thesis strategies for the recombinant expression and subsequent purification of chalcone-3-hydroxylase (CH3H), a novel membrane-bound cytochrome P450 enzyme from Dahlia variabilis, were developed and investigated. Different protein variants and expression hosts including Escherichia coli, Pichia pastoris and Saccharomyces cerevisiae were employed and investigated concerning recombinant expression of CH3H. Not only was their suitability as hosts evaluated in regard to CH3H expression levels, but also new, more sustainable ways of recombinant protein production were examined. Further, a purification strategy for the membrane-bound CH3H was developed by systematic investigation and optimization of each downstream processing step. This ultimately allowed biochemical characterization of CH3H and will potentially serve as basis for future crystallization of the enzyme, which is important for structural elucidation and shedding light on the ability of CH3H to hydroxylate chalcones in position 3. Additionally, we believe that the methods developed in this Thesis for production as well as purification of CH3H are at least to some extent also applicable for the production of other enzymes, especially similar plant cytochrome P450s. Up to now, these are drastically underrepresented in cytochrome P450 research, in spite of their high abundance. The studies conducted within this Thesis can serve as a good starting point to further explore plant cytochrome P450s, which produce various kinds of secondary metabolites that have been shown to exhibit health beneficial effects including antibacterial, antiviral and anticancer properties.
