Development of an in-vitro testing strategy for evaluation of skin compatibility of medical device extracts

Abstract

Progress in technology and rising knowledge about diseases led to the design of more innovative medical devices composed of complex materials. In order to guarantee safety for the patients and avoid adverse reactions of the body, the materials have to be assessed for their biocompatibility. Standing regulations (e.g. ISO 10993) deal with a testing strategy mainly focused on in-vivo tests. Social pressure and concerns about animal welfare have led to the development of alternative, in vitro methods. Such in-vitro tests were first introduced by the cosmetic industry and were successful in the detection of the skin irritation and skin sensitizing potential of pure chemicals. In order to evaluate medical device extracts, these methods were adopted and redesigned to allow sensitive and accurate testing of complex mixtures for skin irritation and skin sensitization. To enable testing of solid samples, an appropriate extraction process was specified and parameters influencing its outcome were identified. Out of these extracts, assessment of the skin irritation potential was reached through 3D skin models. Since skin sensitization is a complex allergic reaction, no stand-alone test is supposed to sufficiently predict sensitizers. Therefore, a combination of two in-vitro assays was established. The NanoSens is focused on the ARE Nrf2 pathway, which is involved in the sensitization process and the DPRA (direct peptide reactivity assay) is used to detect reactivity of small molecules towards peptides, which is described to be the molecular initiation event of skin sensitization. These assays were established and validated. The development of a third assay for testing of skin sensitization, the h-Clat assay, was not successful with sample extracts. Critical parameters for the extraction methods were the choice of the extraction vessel, the interaction between material and solvent, sample cutting surface and geometry of the device, whereas the rotation speed did not have an impact on the amount of extractants. For detection of damage of cells and further skin irritation, the 2D cytotoxicity test was more sensitive than methods with 3D skin models. Assays for skin sensitization detected far lower concentrations of sensitizers compared to in-vivo data from the state-of-the-art test LLNA (local lymph node assay). Further, an approach to deal with derived data for risk assessment of medical devices was elaborated and samples were screened applying this testing strategy. Out of 23 tested samples, 39% were classified as not skin compatible, 52% as skin compatible and further assessment was necessary for the remaining 9%. The results of this thesis show that in-vitro testing of complex extracts is possible and can be applied as an alternative in the risk assessment of medical devices.

Durch technologischen Fortschritt und immer besseres Verständnis von Krankheiten kommt es zur Entwicklung von innovativen Medizinprodukten aus immer komplexeren Materialien. Um die Sicherheit gegenüber den Patienten zu gewährleisten und so unerwünschten Reaktionen vorzubeugen, müssen diese Materialien auf ihre Biokompatibilität untersucht werden. Schlagende Normen (z.B. ISO 10993) behandeln diese Teststrategie und fokussieren hauptsächlich Tierversuche. Sozialer Druck und Tierschutz führten zur Entwicklung alternativer, in-vitro Methoden. Solche Tests wurden als erstes in der Kosmetikindustrie eingesetzt und konnten hautirritierende und -sensibilisierende Reinsubstanzen erfolgreich detektieren. Um Extrakte von Medizinprodukten zu evaluieren, wurden diese Methoden adaptiert und verändert um sensitives und akkurates Testen auf Hautirritationen und Hautsensibilisierung zu ermöglichen. Um feste Proben zu testen, wurde ein Extratkionsprozess und dessen Einflussfaktoren definiert. Von diesen Extrakten konnte eine Hautirritation wurde mittels 3D Hautmodellen ermittelt werden. Da Hautsensibilisierung eine komplexe allergene Reaktion ist, wird davon ausgegangen, dass kein eigenständiger Test das Sensibilsierungspotential von Substanzen ausreichend vorhersagen kann. Daher wurde eine Kombination aus 2 in-vitro Methoden etabliert. Der NanoSens basiert auf dem ARE Nrf2 Signalweg, welcher im Sensibilisierungsprozess involviert ist, und der DPRA (direct peptide reactivity assay) Test detektiert die Reaktivität von kleinen Molekülen gegenüber Peptiden, welche als molekulares, einleitendes Ereignis der Sensibilisierung beschrieben ist. Diese Methoden wurden etabliert und validiert. Die Entwicklung eines dritten Tests, dem h-Clat, ist fehlgeschlagen. Kritische Parameter bei der Extraktion waren die Extraktionsgefäße, die Interaktion zwischen Material und Extraktionsmittel, die Rauigkeit der Oberfläche sowie die Geometrie der Probe. Die Schüttelgeschwindigkeit hatte keine Auswirkung auf die Menge an extrahierten Substanzen. Zur Detektion von Zellschädigung und Irritation war der 2D-Zytotoxizitätstest sensitiver als Methoden mit 3D Hautmodellen. Die Methoden zum Nachweis von Hautsensibilisierung konnten viel kleinere Konzentrationen an sensibilisierenden Substanzen detektieren, wenn man diese mit in-vivo Daten vom Standard-Test LLNA (local lymph node assay) verglich. Außerdem wurde ein Strategie erarbeitet, wie man mit die Ergebnisse für eine Risikoabschätzung der getesteten Proben heranziehen kann. Unter dieser Strategie kam es zu einem Probenscreening. Von 23 getesteten Medizinprodukte-Prototypen wurden 39% als nicht biokompatibel und 52% als biokompatibel klassifiziert. Weitere Tests waren für die verbleibenden 9% notwendig. Die Ergebnisse zeigen, dass das in-vitro Testen von komplexen Extrakten möglich ist und als Alternative zu Tierversuchen zur Risikobewertung von Medizinprodukten herangezogen werden kann.