Strain engineering of trichoderma reesei

Abstract

The ascomycete Trichoderma reesei is an industrial producer of technical enzymes, especially for cellulases and hemicellulases. As such it is an interesting target for genetic engineering and optimisation as microbial production host. The development demands a growing genetic toolbox to optimise product yields and process parameters. The first approach was the design of an artificial promoter. The promoter of the uncharacterized gene cdna1 (Pcdna1) is one of the strongest in T. reesei active during growth on glucose. Although stronger promoters exist, they are repressed by glucose or require activation. In order to design a synthetic core promoter with defined characteristics, high strength and no repression effects on glucose, we analysed 50 highly expressed genes towards their core promoter structure. A box structure system was established, a box is a conserved 5-45 bp long sequence within the promoter. Two sequences based on native core promoters and one completely de novo designed one were used as basis to arrange the boxes, ultimately generating 200 bp long artificial core promoters, controlling the expression of the reporter gene cellulase CEL12A. The design of the artificial core promoters included known sequences like TATA-boxes, GC-boxes or CT-rich regions, but also newly found boxes from the sequence analysis. Two of the synthetic core promoters surpassed the expression strength of the native reference core promoter of cdna1 by about 175%. To gain a full-length promotor, these two superior synthetic core promoters were elongated with different distal promoter regions. Surprisingly, all combinations resulted in different activity values, which suggests that the core promoters were not effective with each of the distal promoters. The results form the basis for a deeper analysis or the relation of different promoter elements. The second object of interest was the morphology of the fungus. As most of the energy consumption is used to generate biomass, it is interesting for industrial processes to develop a system in which the growth of T. reesei can be regulated. Aim of this study was to optimise product output by limitation of growth during fermentation by downregulation of specific chitin synthases and one glucan synthase. Therefore, the native promoters of chs1, chs2, chs3, chs6 and fks1 were replaced by the L-methionine repressible promoter of tauD1. Transcript levels showed that the repressible promoter of tauD1 was effectively repressed by the addition of 0.1 mM L-methionine, but the addition of the amino acid also led to an increase of biomass formation and a decline in specific cellulase activity. The overexpression of 1,3-β-glucan synthase FKS1, caused by the tauD1 promoter in an unrepressed stage, led to a compact pellet growth and less biomass formation in liquid culture in QM9414 based strains and in the industrial ancestor strain RUT-C30. Interestingly, the altered phenotype was accompanied by an increased cellulase activity in the supernatant in QM9414 strains but led to a complete abolishment of cellulase activity in RUT-C30. The results of the study opened a new opportunity for morphology engineering of T. reesei and model for similar experiments in other filamentous fungi. Another approach to further increase protein production was the introduction of hyperbranching. Since most of exocytosis is located at the hyphal apical tip, more branches could result in more protein secretion. RAC plays a crucial role in actin dynamics and is involved in polarisation of the cell during germination and apical extension of the hyphae. Rac1 deletion caused a hyperbranching phenotype with dichotomous branching, shorter total hyphae length and a larger hyphal diameter. While extracellular cellulase activities remained at parental strain levels on D-glucose and cellulose, the specific activity on lactose cultures was increased up to three times at 72 hours accompanied by an upregulation of transcription of the main cellulases. Although the morphology of the Δrac1 strains was considerably altered, the viscosity of the culture broth in a fed-batch fermentation was not significantly different in comparison to the parental strain. Our study demonstrates that enhanced protein secretion is not per se related to the number of tips. The thesis contributes to strain improvement of T. reesei and broadened our understanding in the experimental field of synthetic biology and morphology engineering.

Der Ascomycet Trichoderma reesei ist ein in der Industrie etablierter Mikroorganismus für die Produktion von technischen Enzymen, besonders von Cellulasen und Hemicellulasen. Als mikrobieller Produktionswirt ist T. reesei ein interessantes Studienobjekt zur genetischen Stammverbesserung, um seine Proteinausbeute und Fermentationseigenschaften zu optimieren. Ein Ansatz zur Stammverbesserung ist die Entwicklung synthetischer Promotoren. Der Promotor des uncharakterisierten Gens cdna1 ist einer der stärksten in T. reesei während dem Wachstum auf Glucose. Obwohl prinzipiell stärkere Promotoren existieren, sind diese auf Glucose entweder reprimiert oder benötigen eine Aktivierung. Um einen synthetischen Kernpromoter mit definierten Eigenschaften designen zu können, nämlich hohe Expressionsstärke und keine Reprimierung bei Anzucht auf Glukose, wurden 50 hoch exprimierte Gene bezüglich ihrer Kernpromoterstruktur untersucht. Aus dieser Analyse wurde ein Boxensystem abgeleitet, wobei eine Box eine konservierte Sequenz von 5 bis 45 Basenpaaren darstellt. Die Boxen wurden auf zwei natürlichen und einer zuvor völlig de novo designten synthetischen Basissequenzen arrangiert, um so 200 bp lange Kernpromotoren zu formen, die die Expression der Reporterzellulase CEL12A kontrollieren. Das synthetische Design umfasste bekannte Motive wie TATA-Boxen, GC-Boxen oder CT-reiche Regionen, aber auch in dieser Studie neu gefundene Sequenzen. Zwei dieser synthetischen Konstrukte überstiegen die Aktivität des Referenzpromotors von cnda1 deutlich, um 175 %. Um einen Promotor mit voller Länge zu generieren, wurden diese zwei Kernpromotoren mit verschiedenen distalen Promotorteilen verlängert. Alle diese Kombinationen führten zu unterschiedlichen Aktivitäten, was darauf hindeutet, dass die Kernpromotoren nicht effektiv mit jedem beliebigen distalen Promotorteilen kombiniert werden kann. Diese Ergebnisse bilden eine solide Basis für weitere Analysen zum komplexen Zusammenspiel verschiedener Promotorteile. Der zweite Teil der Arbeit behandelte die Optimierung der Morphologie des Pilzes. Da viel Energie in den Aufbau von Biomasse fließt, ist es für industrielle Prozesse interessant ein System zu entwickeln, mit dem das Wachstum von T. reesei genetisch reguliert werden kann. Um eine Optimierung der Produktmenge durch Wachstumslimitierung während einer Fermentation zu erreichen, wurden ausgewählte Chitinsynthasen und einer Glucansynthase unter einen regulierbaren Promotor gestellt. Dazu wurden die natürlichen Promotoren der chs1, chs2, chs3, chs6 und fks1 Gene durch einen mit L-Methionin reprimierbaren Promotor des Gens tauD1 ersetzt. Die Transkriptdaten zeigten eine effektive Reprimierung bei Zugabe von 0,1 mM L-Methionin, allerdings führte der Zusatz der Aminosäure zu einer erhöhten Biomassebildung und einem Abfall der Zellulaseaktivität im Überstand. Die durch den tauD1-Promoter erzeugte Überexpression der β-1,3-Glucansynthase fks1 führte im unreprimierten Zustand zur einem kompakten Pelletwachstum und einer verminderten Biomassebildung in Flüssigkulturen, sowohl in QM9414 als auch im Industriestamm RUT-C30. Interessanterweise war dieser Phänotyp in QM9414 von einer erhöhten Zellulaseaktivität begleitet, führte bei RUT-C30 jedoch zu einer vollständigen Reduktion ebendieser. Die Ergebnisse dieser Studie eröffneten eine neue Möglichkeit der Morphologieoptimierung in T. reesei und kann als Model für ähnliche Studien in anderen filamentösen Pilzen verwendet werden. Eine weitere Möglichkeit um die Protein Produktion zu steuern ist das Erzeugen eines Hyperbranchers. Da die Hyphenspitze viel Proteine sekretiert, könnten mehr Verzweigungen mehr Proteinsekretion bedeuten. Die kleine GTPase RAC spielt eine wichtige Rolle in der Actindynamik und ist auch in die Polarisierung der Zelle während der Sporulation und dem vegetativen Wachstum involviert. Die Deletion von rac1 in T. reesei führte zu einem Hyperbrancher-Phänotyp mit dichotomen Verzweigen, kürzerem Hyphen und dickeren Hyphendurchschnitten. Die Cellulaseproduktion auf Glukose und Zellulose der rac1 deletierten Stämme entsprach der des Ausgangsstammes, doch auf Laktose konnte nach 72 Stunden ein Anstieg in der Aktivität und der Geamtproteinmenge auf das dreifache Niveau beobachtet werden zusammen mit einem Anstieg der Transkriptlevel der Hauptzellulase. Trotz der starken Morphologieveränderung hat sich die Viskosität der Deletionsstämme im Fed-Batch Reaktor im Vergleich zum Referenzstamm nicht signifikant verändert. Die Studie hat gezeigt, dass die Menge an sekretiertem Protein nicht direkt mit der Anzahl der Hyphenspitzen zusammenhängt. Diese Arbeit hat insgesamt zu einem besseren Verständnis verschiedener Möglichkeiten zur Stammverbesserung von T. reesei beigetragen, sowie das Wissen im Bereich der synthetischen Biologie und Morphologieoptimierung erhöht.