Funktionelle Charakterisierung eines neuen Gen-Clusters in Trichoderma reesei

Abstract

Trichoderma reesei ist ein industrieller Cellulase- und Hemicellulaseproduzent, dessen Enzyme in der Lage sind, pflanzliche Biomasse wie Lignocellulose in seine Einfachzucker zu depolymerisieren, die eine wichtige Quelle zur Herstellung von Biokraftstoffen bilden. Um die Produktion rekombinanter Proteine und Enzyme zu verbessern, werden neue neutrale Inducer und Promotoren benötigt, die weder die Cellulaseproduktion noch das Pilzwachstum negativ beeinflussen. Diese Eigenschaften treffen auf die Pantothensäure als Inducer und einige Pantothensäure induzierbare Gene zu, die mittels Microarrays identifiziert wurden. Bei den Pantothensäure induzierbaren Genen, handelt es sich um 4 Gene, die vermutlich für Enzyme des intrazellulären Pantothensäure-Abbaus kodieren, und um ein Ortholog der Liz1 Pantothenatpermease aus Schizosaccharomyces pombe. Diese Gene sind in einem Gen-Cluster lokalisiert, in dem sich noch ein zusätzlicher Transkriptionsfaktor befindet, der ein Zn2/Cys6 binukleares Zink-Cluster-Motiv aufweist. Um die Rolle dieser Gene bezüglich im Pantothensäure-Abbau und der Regulation der Gene im Cluster zu charakterisieren, wurden die Gene durch Gen-Knockout deletiert. Dafür wurden für alle sechs Gene des Clusters Deletionsvektoren basierend auf der Hygromycin B Resistenz-Expressionskassette konstruiert und die Deletionsfragmente in T. reesei transformiert. Analyse der Transformanten mittels diagnostischer PCR zeigte, dass für alle Gene die entsprechenden Deletionsstämme erhalten wurden. Die deletierten Stämme zeigten weder auf Vollmedium, noch auf Minimalmedium mit Glucose einen Wachstumsdefekt. Ein schwacher Wachstumsdefekt wurde mit Pantothensäure als Kohlenstoffquelle nachgewiesen. Eine Expressionsanalyse mit Hilfe quantitativer Real Time PCR zeigte, dass der Transkriptionsfaktor dieses Clusters für die Regulation der anderen 5 Gene verantwortlich ist und in Abwesenheit dieses Transkriptionsfaktors keine Induktion durch Pantothensäure mehr erfolgt. Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen kann das neue Expressionssystem bestehend aus der Pantothensäure als Inducer und den Pantothensäure induzierbaren Promotoren durch metabolisches Engineering des Stoffwechselweges oder Veränderung der Expression des Transkriptionsfaktors weiter verbessert werden.

Trichoderma reesei is an industrial cellulase and hemicellulase producer whose enzymes are capable of depolymerizing plant biomass like lignocellulose into its monosaccharides which represents a feedstock for production of biofuels. In order to optimize the production of recombinant proteins and enzymes, novel neutral inducers and promoters are required which neither have a negative impact on the cellulase production nor on the fungal growth. These features apply for pantothenic acid and some pantothenic acid inducible genes identified by microarray analysis. The pantothenic acid inducible genes comprise four genes which are coding for enzymes putatively involved in intracellular pantothenic acid degradation and one orthologue of the Liz1 pantothenate permease from Schizosaccharomyces pombe. These genes are localized in a cluster which involves an additional transcription factor with a Zn2/Cys6 binuclear zinc cluster motive. In order to characterize these genes with regard to their roles in the pantothenic acid degradation and the regulation of the genes in the cluster, all six genes were deleted via gene knock-out. For this, deletion vectors were constructed for based on the hygromycin B resistance expression cassette and the six deletion fragments were transformed in T. reesei. Analysis of the transformants via diagnostic PCR resulted in the identification of deletion strains for all six genes. The individual strains did not show a growth defect neither in complete medium nor in minimal medium with glucose. A weak growth defect was detected with pantothenic acid as a carbon source. An expression analysis with quantitative real time PCR showed that the transcription factor of this cluster is responsible for the regulation of the other five genes, In the absence of this transcription factor, no induction through pantothenic acid occurs. Based on these findings, the novel expression system based on the inducer pantothenic acid and pantothenic acid inducible promoters can be further improved by metabolic engineering of the metabolic pathway or by altering the expression of the transcription factor.