Controlling the hidden bioprocess diversity by MALDI-TOF MS biotyping

Abstract

Matrix-unterstütze Laser-Desorption/Ionisation-Flugzeit-Massenspektrometer (MALDI-TOF-MS) sind vielseitige, leistungsfähige Geräte im Bereich der Analytischen Chemie. In eine geeignete MALDI-MS Matrix eingebettet, können Proteine, Peptide, Poly- und Oligonukleotidketten sowie Lipide, Kohlenhydrate, synthetische Polymere und andere Analyten hochempfindlich detektiert werden. Außerdem können sogar vollständige Zellen als Analyt eingesetzt werden. Die zugehörige Technik wird - Intact Cell Mass Spectrometry - (Massenspektrometrie von intakten Zellen, ICMS) genannt. Durch ICMS können Mikroorganismen ohne DNA-Extraktion und Sequenzierung identifiziert werden was diese Methode zu einem besonders raschen Werkzeug im Bereich der Mikrobiologie macht. Außerdem ist bekannt, dass mittels ICMS Fermentationsstadien filamentöser Pilze überwacht werden können. Diese Anwendung ist im besonderen Interesse der pharmazeutischen Industrie, da Mikroorganismen als häufige Wirtsorganismen für die biotechnologische Herstellung von Wirkstoffen eingesetzt werden, beispielsweise Proteine, Peptide Kohlenhydrate oder kleinerer Moleküle. Während der Herstellung können kleine Änderungen den Prozess stören und letztlich zu Qualitäts- oder sogar zum Produktverlust führen. Das wirtschaftliche Interesse ist daher hoch, jene geeigneten Techniken zu entwickeln, die es erlauben, solche Prozessänderungen rasch zu detektieren und sofort darauf zu reagieren, um so die Produktspezifikation einzuhalten. Daher stellt sich die Frage, ob ICMS für die Überwachung einer industriellen Fermentation geeignet ist. Bisher sind nur wenige zeitabhängige ICMS Studien bekannt, doch wurden allesamt nicht unter dem Gesichtspunkt einer späteren Automation erstellt. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag daher in robuster Probenpräparation, um schnelle und empfindliche Messungen zu erreichen. Des Weiteren wurde eine Methode erstellt, welche die die Aufnahme hochreproduzierbarer Spektren ermöglicht. Daten, die von zwei unabhängigen Fermentationen des Bakteriums Escherichia coli gewonnen wurden, konnten in einer Methodik verwendet werden, welche die Klassifizierung zukünftiger Massenspektren nach drei Prozessphasen erlaubt. Zukünftige Forschungen werden weiter die Automatisierung und die »at line« - Implementation am Industriestandort zum Ziel haben um festzustellen ob die Methode auch empfindlich genug ist, um die Bioprozessdiversität der Fermentation im industriellen Maßstab aufzuzeigen.

Matrix assisted laser desorption and ionisation (MALDI) time of flight (TOF) mass spectrometers (MS) are versatile, powerful devices in the field of analytical chemistry. Embedded into a suitable matrix, peptides, poly- and oligonucleotides, lipids, carbohydrates, synthetic polymers and other analytes can be detected very sensitively. Moreover, entire cells can be used as analyte. The according technique is termed intact cell mass spectrometry (ICMS). ICMS can be utilised to identify microorganisms without DNA extraction and sequencing, making ICMS a rapid tool in microbiology. It is also known that ICMS can be used to monitor stages of fungal fermentation. This is of particular interest for the pharmaceutical industry, as microorganisms are common hosts for the biotechnical production of certain active pharmaceutical ingredients (API) such as proteins, peptides, carbohydrates or small molecules. The bioprocesses to gain the desired substances might become influenced by small changes, ultimately leading to quality or even product loss. High economical interest lies in the development of modern monitoring techniques, allowing quick detection and immediate response to process alterations in order to stay within product specifications. The question has arisen if ICMS could be utilised to monitor industrial fermentations. So far, only a few time-dependant ICMS studies exist but none of them were undertaken in the perspective of automation. This work focuses on robust sample preparation to archive fast and sensitive measurements. A method to gather highly reproducible spectra was developed. Spectra obtained from two independent fermentations of Escherichia coli were used for the establishing of a methodology, capable to classify future data into three process stages. Future research will focus on automatisation and at line implementation to see if this analytical approach is actually sensitive enough to uncover bioprocess diversity of large scale fermentations.