Development of rapid on-site applicable methods for the detection of faecal pollution in water

Abstract

The consumption of water contaminated with faeces might lead to numerous infectious diseases. This problem is prevalent not only in developing countries but poses a severe global health burden. Therefore, standardized analytical methods are applied to assess the microbiological quality of water that is used for drinking or recreational purposes. While cultivation-based techniques have been primarily deployed over the last decades, molecular tools such as polymerase chain reaction (PCR) are becoming increasingly important. Using DNA-based detection methods, the analysis time can be reduced to a few hours, but they require sophisticated instrumentation and trained personnel. Furthermore, time-consuming sample preparation steps such as DNA extraction are needed, all of which renders these methods unsuitable for regions without appropriate facilities. Hence, there is a strong need for novel methods that can be applied in low-resource settings or directly in the field. To tackle these challenges, we aimed for the implementation of an alternative molecular diagnostic workflow serving as a screening tool for the rapid assessment of microbiological water quality. Most importantly, the involved methods should be feasible for applications in areas lacking molecular biological laboratory infrastructure. For this purpose, novel strategies for sample preparation and genetic marker analysis should be developed and compared to selected reference methods. As a first step, we addressed the issue of extracting the genomic DNA from bacteria. In recent years, ionic liquids (ILs) have been shown to successfully lyse animal, plant, and also Gram-negative bacterial cells. We selected and synthesized a set of hydrophilic ILs and tested them in combination with different aqueous buffer systems for their inhibitory effects on quantitative PCR (qPCR). In a subsequent cell lysis experiment with Enterococcus faecalis as model organism, the two most suitable candidates were chosen and further optimized with regard to IL concentration, incubation time, and applied temperature. The extraction efficiencies of the individual combinations were measured by a reference qPCR assay targeting the 23S rRNA gene in Enterococcus species. We then applied this protocol to seven more Gram-positive and -negative bacterial type strains and compared the results to a common enzymatic extraction procedure and two commercial kits. In summary, the IL-based methods showed better efficiencies than the kits for most of the reference strains, while generally outcompeting all methods regarding duration and costs per sample. To become independent from sophisticated instrumentation that is required for (quantitative) PCR reactions, isothermal DNA amplification methods have emerged over the last two decades. These methods work at a constant temperature and can therefore be applied on a standard heating block. To this end, we adapted the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technique for the detection of genetic markers that are specific for enterococci. We designed the primers based on a qPCR assay implemented by the U.S. Environmental Protection Agency, which we selected as our reference method to compare the results. The key parameters of the assay were evaluated using 15 Enterococcus type strains as well as 15 closely and distantly related bacterial species that might be present in a water sample. Furthermore, we analysed Enterococcus species isolated from Austrian water bodies and a set of environmental water samples with a varying extent of faecal pollution. All results were statistically evaluated and showed no significant differences to the reference method. Advantageously, the LAMP assay can be performed in 45 minutes at a constant temperature of 64 °C, and a subsequent staining procedure enables the rapid visualization of the amplification products by eye. In conclusion, the developed methods represent essential cornerstones for a molecular diagnostics workflow that is suitable to be applied by non-experts using inexpensive equipment. It is intended to become a screening tool that can be used by researchers and public authorities for rapid on-site measurements. In addition, it can be applied in regions without a proper laboratory infrastructure to assess the microbiological quality of water. While the novel extraction method and the Enterococcus LAMP assay are important starting points for moving DNA-based analytics out into the field, future effort must be put at implementing the entire analysis pipeline in a portable easy-to-use format such as a microfluidic device. Providing prefabricated cartridges that can be combined with an energy-self-sufficient handheld device will be a vital step to further endorse point-of-care applications not only in the area of water quality analysis.

Der Konsum von fäkal verunreinigtem Wasser kann zu einer Vielzahl an Infektionskrankheiten führen. Dieses Problem ist nicht nur in Entwicklungsländern weitverbreitet, sondern stellt ein weltweites Gesundheitsrisiko dar. Daher werden standardisierte Methoden angewendet, um die mikrobiologische Qualität von Trinkwasser und Badegewässern zu beurteilen. Während in den vergangenen Jahrzehnten hauptsächlich kultivierungsbasierte Techniken zum Einsatz kamen, gewinnen molekulare Methoden wie die Polymerasekettenreaktion (PCR) immer mehr an Bedeutung. Obwohl mit DNA-basierten Nachweisverfahren die Analysezeit auf ein paar Stunden reduziert wird, müssen diese von ausgebildetem Personal mithilfe spezieller Gerätschaften durchgeführt werden. Weiters sind zeitaufwändige Probenvorbereitungsschritte (z.B. DNA-Extraktion) notwendig, wodurch diese Methoden ohne entsprechende Laboreinrichtungen ungeeignet sind. Daher besteht ein großer Bedarf an neuartigen und feldtauglichen Schnellmethoden, die unter derartigen Gegebenheiten in Entwicklungsländern beziehungsweise direkt am Ort der Probennahme eingesetzt werden können. Das Ziel dieser Arbeit war, ein alternatives molekulardiagnostisches Analyseverfahren zu realisieren, das zu einer schnellen Erstbegutachtung der mikrobiologischen Wasserqualität dient. Die verwendeten Methoden sollen dabei in Gegenden ohne molekularbiologische Laborinfrastruktur durchführbar sein. Im ersten Schritt wurde die Extraktion der genomischen DNA aus Bakterien thematisiert. In den vergangenen Jahren konnte gezeigt werden, dass ionische Flüssigkeiten (ILs) imstande sind, tierische und pflanzliche Zellen als auch Gram-negative Bakterien erfolgreich zu lysieren. Daher wurde eine Auswahl an hydrophilen ILs in Kombination mit verschiedenen wässrigen Puffersystemen hinsichtlich ihrer inhibitorischen Effekte auf quantitative PCR (qPCR) überprüft. In einem nachfolgenden Zelllyseexperiment mit Enterococcus faecalis als Modellorganismus wurden die zwei besten Kandidaten ausgewählt und hinsichtlich IL-Konzentration, Inkubationszeit und Temperatur optimiert. Im Anschluss wurde dieses Extraktionsprotokoll an sieben weiteren Gram-positiven und -negativen Bakterienstämmen getestet und die Ergebnisse mit einer weitverbreiteten enzymatischen Extraktionsmethode sowie zwei kommerziellen Kits verglichen. Zusammengefasst zeigten die IL-basierten Verfahren für die meisten Referenzstämme bessere Effizienzen als die Kits und waren allen Methoden hinsichtlich Dauer und Kosten deutlich überlegen. Um von den Gerätschaften für qPCR-Reaktionen unabhängig zu werden, haben sich in den vergangenen zwei Jahrzehnten isothermale DNA-Amplifikationsmethoden etabliert. Diese können bei konstanter Temperatur und dadurch auf einem herkömmlichen Heizblock durchgeführt werden. Zu diesem Zweck wurde in dieser Arbeit die Methode der Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) für den Nachweis von Enterococcus-spezifischen genetischen Markern adaptiert. Die Primer wurden in Anlehnung an einen qPCR-Assay konzipiert, der von der US-amerikanischen Umweltschutzbehörde implementiert wurde und in dieser Arbeit als Referenzmethode diente. Die wichtigsten Parameter wurden anhand von 15 Enterococcus-Reinstämmen und 15 verwandten Spezies evaluiert. Weiters wurden aus österreichischen Gewässern isolierte Enterococcus-Spezies und ein Set aus Umweltgewässerproben analysiert. Alle Ergebnisse wurden statistisch ausgewertet und zeigten keine signifikanten Unterschiede zur Referenzmethode. Der LAMP-Assay bietet schlussendlich den Vorteil, dass er in 45 Minuten bei konstanten 64 °C durchgeführt werden kann. Eine anschließende Färbereaktion ermöglicht zudem die schnelle Visualisierung der Amplifikationsprodukte mit freiem Auge. Zusammenfassend stellen die entwickelten Methoden wichtige Eckpfeiler für ein molekulardiagnostisches Analyseverfahren dar, das von Laien mithilfe kostengünstiger Ausrüstung angewendet werden kann. Dieses Verfahren soll es Forschern und Behörden ermöglichen, eine schnelle Erstbegutachtung von Wasserproben direkt vor Ort durchzuführen. Weiters kann es in Regionen ohne entsprechende Laborinfrastruktur angewendet werden, um die mikrobiologische Wasserqualität zu bestimmen. Obwohl die neuartigen Methoden wichtige Startpunkte darstellen, um DNA-basierte Analyse feldtauglich zu gestalten, muss der künftige Fokus darauf liegen, das Verfahren zur Gänze auf ein tragbares und einfach anzuwendendes Format zu übertragen. Um derartige vor-Ort-Anwendungen nicht nur auf dem Gebiet der Wasserqualitätsanalyse weiter zu forcieren, wird es daher notwendig sein, gebrauchsfertige Reagenzien herzustellen, die mit einem energieautarken, handlichen Analyseinstrument kombiniert werden können.