Integration of microparticle technology in downstream train

Abstract

Heutzutage ist die Hochdruckhomogenisation der Industriestandard zur Herstellung von intrazellulär exprimierten Biopharmazeutika aus E. coli. Im Falle der Gewinnung von löslichen Produkten aus E. coli werden alle zellulären Bestandteile mittels Hochdruckhomogenisation unspezifisch freigesetzt. Diese behindern in weiterer Folge die Downstreamprozesse und verlängern die Prozesszeiten. Eine potentielle Alternative ist die Mikropartikelextraktion, die beim Aufschluss hohe Ausbeuten sowie Selektivität erzielt und die anschließende Downstreamprozesse erleichtern könnte. In dieser Arbeit wird ein Downstreamprozess nach Mikropartikelextraktion entwickelt und mit dem Downstreamprozess nach einem Aufschluss mittels Hochdruckhomogenisation bezüglich Ausbeute, Produktivität, UV/Vis Reinheit, DNA- und Endotoxinkonzentration verglichen. Unsere Arbeitshypothese besagte, dass durch die Mikropartikelextraktion einerseits die Capture-Chromatographie übersprungen werden könnte und dass andererseits die Produktivität des darauffolgenden Chromatographieschrittes verglichen zu einem konventionellen Prozess gesteigert werden könnte. Zur Prüfung dieser Hypothese wurden sowohl ein Aufreinigungsprozess nach Mikropartikelextraktion als auch ein konventioneller Aufreinigungsprozess im Labormaßstab entwickelt. Im konventionellen Aufreinigungsprozess wurde das Produkt mittels Hochdruckhomogenisation freigesetzt, Verunreinigungen mit Polyethylenimin präzipitiert und ein darauffolgender Chromatographieprozess entwickelt. Folglich beinhaltet der konventionelle Prozess einen zusätzlichen Prozessschritt. Die Daten zeigten, dass ein sofortiger Polish Chromatographie Schritt nach der Mikropartikelextraktion kein reines Produkt erzielen konnte und daher der Capture-Chromatographieschritt nicht ausgelassen werden konnte. Allerdings konnte die Produktivität des entwickelten Capture-Chromatographieschrittes verglichen zum konventionellen Prozess um das 1.5-fache gesteigert werden. Dabei waren sowohl die Ausbeute als auch die Produktreinheit am Ende der Mikropartikelprozesskette vergleichbar mit der der konventionellen Prozesskette. DNA- und Endotoxinkonzentration der Mikropartikelextrakte war um 8 beziehungsweise 4 Größenordnungen niedriger als die der Hochdruckhomogenate. Weiters waren DNA- und Endotoxinkonzentration der Mikropartikelextrakte um 3 beziehungsweise 1 Größenordnung geringer als die der polyethyleniminbehandelten Homogenate. Eine Fallstudie hat außerdem gezeigt dass die Integration der Mikropartikelextraktion die Prozesszeit verglichen zum konventionellen Prozess um etwa 30 % verringern kann. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Mikropartikelextraktion eine Alternative zur Hochdruckhomogenisation darstellt, da Mikropartikelextrakte von höherer Reinheit erzeugt werden können, wobei die folgenden Prozessschritte erleichtert werden und die Anzahl der Prozessschritte verringert werden.

Currently, high pressure homogenization is the state-of-the-art primary recovery method for manufacturing of biopharmaceuticals that are intracellularly expressed by E. coli. When soluble products are recovered from E. coli cells using high pressure homogenization, unselective release of all cellular components impairs and prolongs subsequent downstream processing. Microparticle extraction is a potential alternative offering high recovery and selectivity, which can facilitate subsequent downstream processing. In this thesis, a downstream process after microparticle extraction is developed for the model protein mCardinal that was expressed soluble in E. coli. This process is then compared in terms of recovery, productivity, UV/Vis purity, DNA and endotoxin concentration to a purification process comprising of a conventional high pressure homogenization and polyethyleneimine precipitation followed by a downstream process. We hypothesize that microparticle extraction could be used as a primary recovery method that renders subsequent capture chromatography unnecessary and significantly improves productivity of subsequent chromatographic operations compared to conventional processes. In the conventional purification process, high pressure homogenization and polyethyleneimine precipitation replaced microparticle extraction, resulting in an additional process step compared to the microparticle process train. The data showed that the capture chromatography process step could not be skipped after microparticle extraction since the application of a single polish chromatography step did not yield pure product. However, after microparticle extraction, productivity of the capture chromatographic unit operation was 1.5-fold higher while final purity and total recovery were at similar levels for both process trains. DNA and endotoxin concentration of microparticle extracts was 8 and 4 magnitudes lower compared to homogenates, respectively, as well as 3 and 1 magnitude lower compared to polyethyleneimine treated homogenates, respectively. A theoretical case-study revealed that a purification process using microparticle extraction could result in a decreased total process time of approximately 30 % compared to a conventional purification process. Altogether, it was demonstrated that microparticle extraction is a potential alternative to high pressure homogenization by yielding extracts of high purity, decreasing overall process steps and facilitating subsequent downstream process.