Lichti, J. (2013). Identifikation von cis-Elementen im cbh1 Promotor von Trichoderma reesei [Diploma Thesis, Technische Universität Wien]. reposiTUm. http://hdl.handle.net/20.500.12708/79441
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Number of Pages:
81
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Abstract:
Der filamentöse Askomyzet Trichoderma reesei spielt aufgrund seiner hohen sekretorischen Kapazität eine bedeutende industrielle Rolle. Hierbei findet er sowohl in der Produktion extrazellulärer Enzyme als auch in der heterologen Proteinproduktion Anwendung. Seine hydrolytischen Enzyme finden vor allem in der Papier-, Textil-, Lebensmittel- und Futtermittelindustrie sowie bei der Produktion von Cellulose-Ethanol Einsatz. Die Cellobiohydrolase CBHI macht bis zu 60 % aller von T. reesei sekretierten Proteine aus. Dieses Produkt ist auf das "single copy" Gen cbh1 zurückzuführen, dessen Expression überwiegend auf Transkriptionsebene durch verschiedene Transkriptionsfaktoren reguliert wird. Die im cbh1 Promotor bedeutendsten cis-Elemente werden im Laufe der Arbeit genauer erläutert. An der Regulation sind drei positive Transkriptionsfaktoren (Xyr1, Ace2, Hap2/3/5-Komplex) und zwei Repressoren (Cre1, Ace1) beteiligt. Eine weitere wichtige regulatorische Rolle spielt die TATA-Box, welche die Initiation der Transkription einleitet. In seiner Funktion bisher noch nicht ausreichend untersucht ist hingegen die AGAA-Box. Um die für eine gezielte Genregulation verantwortlichen Vorgänge besser verstehen zu können, ist es von Bedeutung zu wissen, welche Basen eines Promotors während der Induktion oder Repression von Transkriptionsfaktoren besetzt sind. In der vorliegenden Arbeit wurde eine neue, hochsensitive in vivo Footprinting Methode angewandt, mit der eine präzise Identifikation von cis-Elementen in Abhängigkeit von der jeweiligen Kohlenstoffquelle möglich ist. Dazu werden fluoreszenzendmarkierte LM-PCR Proben durch eine CGE analysiert. Die Auswertung erfolgt über einen automatisierten Sequenzabgleich mit Hilfe des Programmes ivFAST. Anhand dieser modifizierten in vivo Footprinting Methode konnte ein umfassender Einblick in die von unterschiedlichen Wachstumsbedingungen abhängige, transkriptionelle Regulation des cbh1 Promotors gewonnen werden.
The filamentous fungus Trichoderma reesei is of great industrial importance due to its high secretory capacity. It is used for both production of extracellular enzymes and heterologous proteins. Its hydrolytic enzymes are used in a broad range of industrial applications, such as textile, paper, food and feed industries, as well as in the production of cellulosic ethanol. The major secreted protein is cellobiohydrolase I (CBHI), which may constitute up to 60 % of the secreted proteins. This amount derives from the single copy gen cbh1. The expression of this gene is regulated mostly on the transcriptional level via transcription factors. The most important ones affecting cbh1 are elucidated more precisely in the course of this thesis. There are three transcription factors which positively affect (Xyr1, Ace2, Hap2/3/5-complex) cbh1 transcription and two which mainly act as repressors (Cre1, Ace1). Besides, the TATA-box is of great importance for initiating the transcription, whereas the AGAA-box has not been well examined yet. Knowing which bases of a promoter are targeted by transcription factors during induction or repression of a gene is essential for understanding the mechanisms responsible for regulation. Therefore this thesis uses a new, highly sensitive in vivo footprinting method which allows precise identification of the cis elements involved depending on the condition of interest. For this purpose samples which are generated by ligation-mediated PCR using fluorescent labelling are analyzed via capillary gel electrophoresis. The final analysis is done by an automated sequence alignment using the ivFAST software. This method provides an extensive insight in the condition-dependent transcriptional regulation of the cbh1 promoter.
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Keywords:
Trichoderma reesei; Hypocrea jecorina; In vivo footprint; cbh1; Transkriptionsfaktoren; Transkriptionelle Regulation