Adleff, C. (2014). Tracking labeled erythrocytes in the retina [Diploma Thesis, Technische Universität Wien]. reposiTUm. http://hdl.handle.net/20.500.12708/79550
Der Blutfluss in Gefäßen der Netzhaut steht in direkter Verbindung mit verschiedenen Augenkrankheiten und auch mit Risikofaktoren von systemische Erkrankungen. Gängige Methoden um retinalen Blutfluss zu messen sind Laser-Doppler-Anemometrie (LDA) und Optische Kohärenztomografie (OCT), vor allem deren Erweiterung, die Doppler-OCT. Inhalt dieser Diplomarbeit war die Konstruktion, Optimierung und Anwendung einer neuen leistbaren Methode um diesen Blutfluss mit Hilfe des Fluoreszenz-Markers DiD zu messen. Dabei wurden markierte Erythrozyten mit Hilfe von nah-infrarotem Laserlicht, welches als Linie auf ein retinales Gefäß fokussiert wurde, angeregt. Die Methode beruht dabei auf der geeigneten Fokussierung um die Breite der Laserlinie in der Größenordnung der roten Blutkörperchen (RBC), für eine Tiefe, die mindestens dem Gefäßdurchmesser entspricht, zu gewährleisten. Die Emission der RBCs während der Passage wurde Bandpass gefiltert und mit einem Photoelektronenvervielfacher erfasst. In das Messsystem wurde ein Belichtungs- und Aufnahme System integriert um die retinalen Gefäße des Augenhintergrunds für die Adjustierung der Laserlinie visualisieren zu können. Die detektierten Intensitäten wurden mit einer Datenerfassungskarte aufgenommen und mit einer Software die in LabView geschrieben wurde ausgewertet. Die nötige Sensitivität, um einzelne Zellen erfolgreich aus dem Hintergrundrauschen aufzulösen, wurde erfolgreich an einem in vitro System, bestehend aus einer Glaskapillare mit 160µm innerem Durchmesser und einer hochpräzisen Medikamentenpumpe, bestätigt. Schlussendlich wurde die neue Methode in vivo an einer Long Evans Ratte unter Verwendung von zurück-injizierten markierten Erythrozyten erfolgreich angewandt. Dabei wurde eine speziell konzipierte, einseitig planare Kontaktlinse verwendet, um die Eigenbrechung des Auges zu verhindern und folglich die Eigenschaften der fokussierten Linie zu behalten. Die gemessenen Fluoreszenz-Signale waren in einer erwarteten Größenordnung, wenngleich teilweise kleine, nicht eindeutig vom Hintergrund zu unterscheidende Signal-Spitzen auftraten. Gegen Ende dieser Arbeit wurden vielversprechende Möglichkeiten aufgezeigt um die Sensitivität, die Stabilität während der Messung, und ebenso den Messbereich der Methode zu verbessern. Zukünftige Versuche mit verbesserten Messeigenschaften an verschiedenen Gefäßen und Ratten werden empfohlen um die Genauigkeit der neuen Methode im Vergleich mit anderen Methoden evaluieren zu können.
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The problem of measuring blood flow in the eye has attracted much interest, because adequate blood supply is essential for organ function and related to a number of important eye diseases including glaucoma, age-related macular regeneration and diabetic retinopathy. Additionally, impairment of microcirculation is involved in systemic disorders such as diabetes mellitus, hypertension, cardiovascular diseases or stroke. Laser Doppler velocimetry (LDV) and Doppler optical coherence tomography (OCT) are, amongst others, currently available techniques for measuring relative or absolute blood velocities. Combined with fundus-camera based measurement of vessel diameters, these methods allow calculation of blood flow. In the current thesis we aimed to realize a cheaper and direct approach for measurement of absolute blood flow in retinal vessels. This approach is based on the idea of tracking single erythrocytes labeled with the fluorescent dye DiD and illuminated with laser light. DiD was designed for working near the infrared spectral region, where tissue refractions are decreased. A photomultiplier tube was used to detect band-pass filtered emission signals of a red blood cell passing a laser line with a width in the range of erythrocytes size and a length adjustable to the sighted vessel size. To distinguish the signal of single cells (with a diameter between 6µm and 8µm) from background noise the measurement approach had to resolve both on time and intensity scale. The minimum required time resolution depends mainly on blood speed and the related vessel diameter. The detected signals were measured by a high-performance data acquisition card and on-time analyzed with software written in LabView data analyzing software. With the provided low-cost resources, single cell fluctuations were measured with an in vitro system, based on a glass capillary with 160µm diameter. Furthermore, the measurement technique was successfully utilized to measure blood flow of re-injected, labeled cells in retinal vessels of pigmented Long Evan rats in vivo. In conclusion, we established a new method for direct measurement of retinal blood flow in vivo by counting single, fluorescent labeled red blood cells. Further optimization procedures to improve the sensitivity of this approach are necessary and a comparison to other methods measuring retinal blood flow needs to be performed.