Heterologous expression of two prokaryotic enzymes in Trichoderma reesei

Abstract

Basierend auf dem Konzept der synthetischen Biologie wurden zwei prokaryotische mykotoxin-inaktivierende Enzyme in dem eukaryotischen Wirtsorganismus Trichoderma reesei rekombinant überexprimiert. Dafür wurde der Stamm T. reesei RUT C30, aufgrund seiner Fähigkeit relativ hohe Ausbeuten an Proteinen zu erzielen, verwendet. Für die Überexpression der zwei Zielproteine extrazelluläres FumD, natürlich produziert in Sphingopyxis macrogoltabida, und das intrazelluläre Enzym ZenA, wurde ein konstitutiver cdna1, beziehungsweise ein induzierbarer cel7a (auch bekannt als cbh1) Promotor eingesetzt. Für die Sekretion dieser Enzyme wurden zwei verschiedene Signalpeptide in Kombination mit beiden Promotoren getestet. Für die Bestimmung der extrazellulären Erzeugung von FumD und ZenA durch die rekombinanten Stämme wurde ein Immuno-Blot durchgeführt. Aufgrund der Ergebnisse dieses Experiments konnte gezeigt werden, dass die OEzenA Transformanten, dessen Vektorkonstrukt einen cdna1P Promotor und ein cel7a Signalpeptid enthält, die höchste Ausbeute an sezernierten Protein aufweisen, wobei die höchste Wachstumsrate durch die OEfumD Mutanten mit der Plasmidkombination cdna1P und cel7aS erreicht wurde. Interessanterweise hat die Analyse der Biomasseproduktion der OEzenA Transformanten ergeben, dass diese Stämme im Vergleich zu dem T. reesei Kontrollstamm eine sehr geringe Wachstumsrate erreichten. Allerdings konnte eine toxische Wirkung des ZenA Proteins auf den Wirtsorganismus nicht bestätigt werden. Diese Studie hat ergeben, dass beide Zielproteine erfolgreich durch T. reesei RUT C30 produziert werden konnten. Aufgrund der Ergebnisse dieser Arbeit wurden die jeweils besten zwei Stämme pro Vektorkonstrukt ausgewählt.

An approach of synthetic biology has been applied for the recombinant overexpression of two prokaryotic mycotoxin-inactivating enzymes in the eukaryotic cell factory Trichoderma reesei. The strain T. reesei RUT C30 was used for this purpose due to its ability to achieve relatively high protein secretion capacity. The two target enzymes extracellular FumD, natively produced in Sphingopyxis macrogoltabida, and intracellular ZenA were overexpressed under both constitutive and inducible fungal promoters, respectively. In this respect T. reesei constitutive cdna1 promoter and an inducible promoter of the cellobiohydrolase cel7a (previously known as cbh1) gene were used. To lead the expressed proteins to the eukaryotic secretory pathway signal peptides from two T. reesei proteins were tested in combinations with both promoters. The mutant strains were tested for extracellular production of FumD and ZenA enzymes by immunoblot assays. The results of this experiment show that the OEzenA mutant strains containing the construct consisting of cdna1P promoter and cel7a signal peptide provide the highest total protein secretion of T. reesei host, whereas maximum growth was achieved by OEfumD transformants with the plasmid combination cdna1P and cel7a signal peptide. Interestingly, the analysis of the biomass production of the OEzenA mutant strains revealed very low growth compared to the T. reesei control strain, however, a toxic effect of ZenA on the organism could not be proved. The study indicates that both target proteins were successfully produced in T. reesei RUT C30. As the outcome of this thesis the best two mutants strains corresponding to each vector construct were selected.