Ortner, K. (2015). Die Rolle von Ace1 im Xyr1-Regulon in Trichoderma reesei [Diploma Thesis, Technische Universität Wien]. reposiTUm. http://hdl.handle.net/20.500.12708/79571
E166 - Inst. f. Verfahrenstechnik, Umwelttechnik und Techn. Biowissenschaften
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Date (published):
2015
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Number of Pages:
60
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Keywords:
Transkriptionsfaktoren; Genregulation
de
Transcription factors; gene regulation
en
Abstract:
Der filamentöse Ascomycet Trichoderma reesei hat eine hohe Kapazität, Cellulasen und Hemicellulasen zu produzieren. Diese finden breite Anwendung in der Textil- und Nahrungsmittelindustrie, Getränkebrauerei und Biokraftstoffherstellung. Dabei spalten diese Enzyme Cellulose und Hemicellulose in deren Grundbausteine, wie zum Beispiel Glucose oder Xylose, die dann in industriellen Prozessen weiterverarbeitet werden. Die wichtigste Cellulase ist CBHI (Cellobiohydrolase 1) und eine der wichtigsten Xylanasen ist XYNI (Xylanase 1). In den Promotoren der Gene, die für die beiden Enzyme kodieren, befinden sich Bindungsstellen für die beiden Proteine Ace1 und Xyr1. Xyr1 ist der zentrale Transaktivator des cellulolytischen und xylanolytischen Systems in T. reesei. Xyr1 agiert dabei als Aktivator; Ace1 gilt als Repressor der Cellulase- und Xylanase-Expression. Vorangegangene Forschungen zeigten, dass sowohl Ace1 als auch Xyr1 an den xyn1-Promotor binden können. Um diese Ergebnisse zu stützen und neue Erkenntnisse über das Bindungsverhalten der beiden Proteine an den xyn1- und cbh1-Promotor zu gewinnen, wurden weitere Experimente durchgeführt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Bindung der Proteine an die Promotoren durch EMSA (elektrophoretischer-Mobilitäts-Verschiebungs-Assay) untersucht. Dabei konnte für den xyn1-Promotor bestätigt werden, dass beide Proteine an diesen binden können. Zusätzlich wurden Verdrängungsversuche mit beiden Proteinen in Konkurrenz um die Bindungsstellen im xyn1-Promotor durchgeführt, um zu sehen, wie stark die Konkurrenz zwischen den beiden Proteinen ist. Des Weiteren war dabei von Interesse, ob es einem der beiden Proteine möglich ist, das andere von der Bindungsstelle zu verdrängen. In weiterer Folge wurden EMSA-Versuche mit verschiedenen Sonden aus dem cbh1-Promotor durchgeführt, um das Bindungsverhalten von Ace1 und Xyr1 an diesen näher untersuchen zu können. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, herauszufinden, welche Motive aus Ace1 für die DNA-Bindung benötigt werden. Dazu wurden drei Mutanten hergestellt, und mit diesen EMSA-Versuche durchgeführt: Ace1`1 (-S2 - S147), Ace1*-1 (V153P) und Ace1*-2 (Y285F). Die ersten beiden Mutanten zeigten dasselbe Bindungsverhalten wie Ace1-WT, während Ace1*2 (Y285F) nicht binden konnte. Um dies näher untersuchen zu können, wurden, zusätzlich zu den EMSA-Versuchen, CD-Messungen von Ace1-WT und Ace1*-2 (Y285F) gemacht, um Unterschiede im Gehalt an Sekundärstrukturelementen feststellen zu können. Ein weiterer wichtiger Punkt der Arbeit war, den Expressionsort von Ace1 zu lokalisieren. Dazu wurde ein Fusionsprotein aus Ace1 und mRFP kloniert und in T. reesei exprimiert. Diese T. reesei - Stämme wurden dann mit einem Fluoreszenz - Mikroskop beobachtet, um mögliche akkumulierte Fluoreszenz zu erkennen.
de
The filamentous ascomycete Trichoderma reesei has a high ability to produce Cellulases and Hemicellulases. They are widely used in textile- and food industry, brewery and the production of biofuel. These enzymes cleave celluloses and hemicelluloses into their basic modules like glucose or xylose. The most important cellulase is CBHI (Cellobiohydrolase 1) and one of the most important xylanases is XYNI (Xylanase 1). In the promotor of both genes are binding sites for Ace1 as well as for Xyr1. Xyr1 is the central transactivator of the cellulolytic and xylanolytic system in T. reesei. In these systems Xyr1 acts as an activator, while Ace1 is a repressor. After earlier researches, concerning the binding of Ace1 and Xyr1 to the xyn1-promotor, showed an interaction of both proteins with the promoter, further investigation to understand how Ace1 binds to the xyn1- and the cbh1-promotor were performed by follow-up experiments which should reassess the previous findings as well as give more detailed information about binding of both proteins to the cbh1-promotor. For this master thesis the binding of Ace1 and Xyr1 to the xyn1- and the cbh1-promotor was analyzed with EMSA (electrophoretic mobility shift assay). Experiments revealed that both proteins are able to bind to the xyn1-promotor in the same manner. It was also tested if expulsions between the proteins are possible. For this purpose both proteins were given to the probes in competition. In addition, EMSA experiments with three different cbh1-probes were performed to characterize the binding of Ace1 and Xyr1 to the cbh1-promotor. Another purpose of this work was to investigate, which parts of Ace1 are essential for DNA binding. For this reason, three different mutants were used for further EMSA experiments: Ace1`1 (-S2 - S147), Ace1*-1 (V153P) and Ace1*-2 (Y285F). The first two mutants showed the same binding specifities as the wild type, the last one (Ace1*-2 (Y285F)) was not able to bind DNA. Based on this result, CD-measurements of Ace1-WT and Ace1*2 (Y285F) were done to detect possible differences in the amount of secondary structure elements between these two proteins. In vivo experiments were performed to investigate Ace1 expression. Therefore, a fusion protein of mRFP and Ace1 was cloned and transformed into T. reesei. These T. reesei strains were then observed with a fluorescence microscope to detect possible accumulated fluorescence.
en
Additional information:
Zusammenfassung in englischer Sprache Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers