Optimization of GDF11 downstream process

Abstract

Growth and differentiation factor 11 (GDF11) zeichnet sich nach neuen Studien durch hohes therapeutisches Potential aus (Akhurst 2012, Egerman 2015, Loffredo 2013). Die Erforschung der Aktivität von GDF11 wird durch die komplexe Produktion beschränkt. Zurzeit ist kein Produktions und Aufreinigungs Prozess für GDF11 publiziert. Alle Versuche, GDF11 in einem eukaryotischen System herzustellen, waren nicht zielführend. Um die biologische Aktivität von GDF11 besser erforschen zu können, ist die Produktion von reinem und aktivem Molekül notwendig. GDF11 ist ein Wachstumsfaktor aus der Familie der Transforming growth factor β (TGFβ) superfamily Proteine (TSP). Für andere Mitglieder der TSP, GDF5, BMP2 und BMP9 sind heute Produktionsprozesse publiziert. Alle wurden in Escherichia coli (E. coli) mit nachfolgendem von Inclusion bodies (IB) ausgehenden Aufreinigungsprozess hergestellt. Das Cystin-Knoten Motiv, aus dem die homodimer Struktur besteht, stellt im Refold-schritt eine Herausforderung dar. 2015 ist es bei Boehringer Ingelheim (BI) gelungen, 13.4 mg GDF11 mit 95% Reinheit aus IBs aus E. coli zu produzieren. Basierend auf den Daten von 2015 wurden Ziele der Masterarbeit und Hypothesen formuliert. Das erste Ziel bestand in der Reproduktion des Prozesses aus 2015 mit nachfolgender Optimierung des Refolds und der RPC. Zuletzt sollte die Durchführbarkeit der Produktion von 60 mg GDF11 mit dem optmierten Prozess getestet werden. Die Daten, die während dieser Arbeit erhoben wurden, zeigen die Herausforderungen der Aufreinigung des disulfid-bindungsreichen Proteins auf. Besonderer Augenmerk lag auf der Optimierung des Refolds durch univariate Experimente, Design of Experiments (DoEs) und einem Zwei-Schritt Refold Ansatz. Der Refold wurde von einer Ausbeute von 17% Dimer auf 35% optimiert durch Zusatz von Harnstoff und Veränderung des Redoxagentienverhältnisses. Die Umkehrphasenchromatographie (RPC) wurde dahingehend optimiert, dass die Vorbereitung des Ladematerials verändert wurde von der Zugabe eines Cyclodextrins hin zu Abstoppen des Refolds durch pH Änderung und UFDF. Obwohl diese Vorgehensweisen die RPC stabilisierten, wurde zuletzt dieser Schritt durch eine Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) ersetzt. Die ersten Aufreinigungsschritte bis zum Refold wurden als robust angenommen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sich der Unterschied der IB Qualität auf den gesamten Downstream Prozess auswirkt. Es wurde, wie im Prozess 2015, SDS-PAGE zur Analytik verwendet. Die Grenzen dieser analytischen Methode wurden in dieser Arbeit erreicht. Die Beurteilung der einzelnen Prozessschritte verblieb problematisch durch das Fehlen einer andern etablierten Analytik Methode. Darüber hinaus wird in dieser Arbeit ein Ausblick gegeben, welche weiteren Schritte notwendig sind, um die Aufreinigung mit ausreichender Reinheit und Wiederfindungsrate zu bewerkstelligen.

Growth and differentiation factor 11 (GDF11) has considerably high potential as a therapeutic protein (Akhurst 2012, Egerman 2015, Loffredo 2013). Research on this protein is limited by its complex production procedure. To date no production and purification process for GDF11 was published and attempts to produce it in eukaryotic systems had failed. However, in order to investigate the biological function of GDF11, production of highly pure and bioactive molecules is critically important. GDF11 is a growth factor and a member of transforming growth factor β (TGFβ) superfamily proteins (TSPs). Production processes for other members of the family have been published so far: GDF5, BMP2 and BMP9. All expressions were carried out in Escherichia coli (E. coli) with a subsequent inclusion body (IB) deriving purification process. The cystine knot motif that assembles the homo-dimeric structure with disulfide bonds makes the refold step particularly challenging. In 2015, 13.4 mg GDF11 with 95% purity was purified at Boehringer Ingelheim (BI) from IBs produced in E. coli. Based on this data, aims and hypotheses were phrased for this thesis. Reproduction of the process from 2015 was the first aim, followed by the optimization of the downstream unit operations of refold and RPC. A feasibility study of production of 60 mg target protein should show the robustness of the optimized process. Data generated during this thesis, point out the challenges with this specific disulfide bond-rich protein. Great effort was taken to optimize the refold step using univariate experiments, design of experiments and a two-step refold attempt. The refold was optimized from 17% dimer yield to achieve 35% dimer yield by adding urea and changing the redox agent ratio. The reverse phase chromatography (RPC) was optimized by the changing load preparation procedure from addition of cyclodextrin to quenching by shifting pH and subsequent buffer exchange by UFDF. Finally, this step was replaced by hydrophobic interaction chromatography (HIC). In the course of the work it was found that this method is advantageous because it requires no load preparation. The first unit operations up to the refold were considered robust. However, we could show that the difference in IB quality influences the overall downstream process. As well as in the process in 2015, SDS-PAGE was used as an analytical method during this work. Due to the lack of availability of other analysis methods, the evaluation of the process steps remained difficult. Eventually further steps are suggested in the outlook of this thesis, which might facilitate finalization of downstream process development.