Characterization of PEGylated factor VIII by 1D/2D-HPLC and ESI-MS/-Tandem MS

Abstract

Die Abwesenheit des Blutgerinnungsfaktors Faktor VIII (FVIII), einem essentiellen Glykoprotein, führt bei Menschen zu einer Gerinnungsstörung (Hämophilie A) und wird in der Regel mit der therapeutischen Zuführung des fehlenden Glykoproteins behandelt. Durch die PEGylierung, der Konjugation des Proteins mit Polyethylenglycol (PEG), kann die in vivo Halbwertszeit des Glykoproteins erhöht werden. Durch die Polydispersität von PEG und das Generieren von Stellungsisomeren als auch die Glykanheterogenität stellt die Charakterisierung dieser Konjugate jedoch eine bioanalytische Herausforderung dar. Im Rahmen dieser Arbeit wird die Charakterisierung eines PEGylierten rekombinanten FVIII Produkts, welches auf der N-hydroxysuccinimid (NHS) Ester-Umsetzung basiert, beschrieben. Eine Middle-Down-Umkehrphase (RP) und eine Bottom-Up-RP Methode wurden entwickelt um die Verteilung der PEGylierungsstellen auf dem Glycoprotein und um die Prozesskonsistenz zu beurteilen. Bei der Middle-Down Methode wurden Untereinheiten des Proteins nach einer Spaltung mit Thrombin in einer zweidimensionalen RP-HPLC (Hochleistungsflüssigchromatographie) getrennt, wobei eine Auftrennung von unterschiedlichen PEGylierten Untereinheiten erzielt wurde. Dies ist im Wesentlichen auf die Modifikation/Optimierung der organischen, mobilen Phase in der zweiten Dimension zurückzuführen. Durch eine tandemmassenspektrometrische (MS/MS) Analyse im Niederenergie CID (collision-induced dissociation) Modus der tryptischen Peptide der Untereinheiten konnte gezeigt werden, dass die B-Domäne des Proteins bevorzugt PEGyliert wird. Bei der zweidimensionalen Bottom-Up Methode wurden PEGylierte tryptische Peptide des Proteins aufgetrennt. Die Selektivität wurde hier ebenfalls wesentlich durch die Wahl der organischen, mobilen Phase in der zweiten Dimension erzielt. Beim Vergleich von verschiedenen Batches des PEGylierten rekombinanten Produkts konnte eine sehr gute Übereinstimmung gefunden werden. Die Lokalisierung der PEGylierten Aminosäuren wurde durch eine Kombination von RP-HPLC Elektrosprayionisation (ESI) MS und klassischer Edman-Sequenzierung der PEGylierten Peptide erzielt. Für die eindeutige Lokalisierung der PEGylierten Aminosäuren war die in-source ESI Fragmentierung unabdingbar. Bei den ermittelten PEGylierten Aminosäuren handelt es sich hauptsächlich um Lysine, welche sich mit hoher Wahrscheinlichkeit auf der Oberfläche (Aussenseite) des Glykoproteins befinden.

Absence or insufficient production of the blood coagulation factor VIII (FVIII), a large glycoprotein within the human body can be life threatening (hemophilia A) and is usually addressed by regular therapeutic injections of the protein. PEGylation of FVIII, the attachment of polyethylene glycol (PEG) to the protein is a promising tool to increase the in vivo half-life of the glycoprotein. Despite the benefits, characterization of PEGylated proteins generally poses a challenge due to a number of reasons such as polydispersity of PEG, the generation of positional isomers and glycoform heterogeneity of the protein. In this thesis, the characterization of a PEGylated therapeutic recombinant FVIII product, based on N-hydroxysuccinimide (NHS) ester chemistry with emphasis on the PEGylation sites is described. The development of a middle-down and a bottom-up method provided primary information about PEGylation sites distribution and process homogeneity. In the middle-down approach, thrombin generated subunits of the glycoprotein were separated by reversed phase HPLC (RP-HPLC) in two dimensions. The selectivity of the method allowed a distinction between different PEGylated subunit species as a result of the variation and optimization of the organic mobile phase in the second dimension. Tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis in the low energy CID (collision-induced dissociation) mode of the tryptic peptides of the subunits revealed a PEGylation bias towards the B-domain of the glycoprotein. In the bottom-up approach, a two-dimensional RP-HPLC method was developed in order to separate different PEGylated tryptic peptides. Unique selectivity for the PEGylated peptides was achieved by the choice of organic mobile phase in the second dimension. The reproducibility and stability of the method was demonstrated and highly comparable batch-to-batch data were observed. Elucidation of the PEGylated amino acids was carried out by a combination of RPHPLC electrospray ionization (ESI) MS and classical Edman sequencing of the PEGylated peptides, adding confidence to the generated data. In-source ESI fragmentation proved to be crucial for the localization of the PEGylated amino acids in the sequence which were predominantly lysines and assumed to be located at the outer surface areas of the recombinant glycoprotein.