Cervenka, I. (2020). Selection of DNA-aptamers for Enterococcus faecalis [Diploma Thesis, Technische Universität Wien]. reposiTUm. http://hdl.handle.net/20.500.12708/79840
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Number of Pages:
102
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Abstract:
Aptamere sind kurze einzelsträngige DNA-Moleküle, welche ähnlich wie Antikörper spezifisch und hoch affin an Oberflächenstrukturen von Bakterienzellen binden können. Diese funktionellen Nukleinsäuren haben gegenüber Antikörpern den Vorteil, dass sie leicht und kostengünstig synthetisiert werden können, dass sie bei Raumtemperatur stabil sind, und durch eine unkomplizierte Vorbereitung schnell einsatzfähig sind. Die Generierung von spezifischen Aptameren erfolgt durch ein in vitro Verfahren, das „SELEX“ („Systematic enrichment of ligands by exponential enrichment“) genannt wird.Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Etablierung und Optimierung eines bakteriellen Zell-SELEX Verfahrens zur Auswahl und Identifizierung von Aptameren, die an das Bakterium Enterococcus faecalis (E. faecalis) binden. E. faecalis wurde als Modellorganismus gewählt, für welchen bisher noch keine DNA Aptamere verfügbar sind.In dieser Arbeit wurden Methoden sowie Protokolle für bakterielle Zell-SELEX Experimente entwickelt und optimiert. Überwachungsmethoden basierend auf quantitativer PCR und Schmelzkurvenanalysen wurden genutzt, um den Fortschritt des Selektionsprozesses zu verfolgen. Basierend auf mehreren initialen SELEX-Experimenten konnten letztendlich Protokolle für die Isolierung von E. faecalis spezifischen Aptameren entwickelt werden. Startpunkt dieses Verfahrens war ein ssDNA-Pool mit 10^15 verschiedenen Sequenzen. Aus diesem ssDNA-Pool wurden E. faecalis bindende Aptamere über mehrere Runden mit steigendem Selektionsdruck angereichert. Um Spezifität zu gewährleisten, erfolgten mehrere Gegenselektionsrunden mit anderen Enterokokken und nicht-Enterokokken Spezies. Nach erfolgreicher Anreichung von Sequenzen aus dem ursprünglichen ssDNA-Pool wurden potenzielle Aptamere („Aptamer-Kandidaten“), die an E. faecalis binden, mittels Next-Generation Sequencing und bioinformatischer Analyse identifiziert. Drei Million Sequenzen wurden mittels NGS erhalten, davon wurden 17 potenzielle Aptamer-Kandidaten chemisch synthetisiert und auf ihre Ziel-Bindung untersucht. Unter den getesteten Kandidaten zeigte Aptamer EF05-508 eine hohe Bindungsaffinität mit einem KD-Wert von 37 nM. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der entwickelte Aptamer ein vielversprechender Kandidat für weitere Charakterisierungsstudien ist. Dazu würden umfassendere Tests mit verschiedenen Typenstämmen, Umweltisolaten, Nachweisgrenzen und weiteren Probenmatrizen gehören. Insgesamt bietet das etablierte bakterielle Zell-SELEX Verfahren eine solide Grundlage für die Entwicklung von Aptameren gegen Bakterienzellen und kann für eine Vielzahl gesundheitsrelevanter Bakterien (z.B. Indikatorbakterien, Krankheitserreger und andere Bakterienpopulationen) eingesetzt werden.
Aptamers are short single-stranded DNA molecules that, like antibodies, can bind specifically and highly affine to surface structures of bacterial cells. Compared to antibodies these functional nucleic acids have the advantage that they can be synthesized easily and cost-effectively, that they are stable at room temperature, and that they can be used quickly through uncomplicated preparation. The generation of specific aptamers is carried out by an in vitro method called "SELEX" ("Systematic enrichment of ligands by exponential enrichment").The aim of this work was the establishment and optimization of a bacterial cell-SELEX process to select and identify DNA aptamers that bind Enterococcus faecalis (E. faecalis). E. faecalis was chosen as model organism, for which no aptamers are currently available. Methods as well as protocols for bacterial whole cell-SELEX experiments were developed and optimized in this work. Monitoring methods based on quantitative PCR and melting curve analysis were used to track the progress of the selection process. Based on several pitfall experiments the ultimately established protocols allowed the isolation of aptamers specific to E. faecalis. The starting point of this procedure was a ssDNA pool with ~1015 different DNA sequences. Out of this pool, E. faecalis binding aptamers were selected and enriched over several rounds with increasing selection pressure. To ensure binding specificity, several counter-selection rounds were performed with other Enterococcus and non-Enterococcus spp. After successful enrichment of sequences from the original ssDNA pool, potential aptamers (“aptamer candidates”) binding to E. faecalis were identified using next-generation sequencing [1] and bioinformatic analysis. Three million sequences were obtained through NGS, thereof 17 potential aptamer candidates were chemically synthesized and screened for target binding. Among all candidates tested, aptamer EF05-508 exhibited high binding affinity with a determined KD – value of 37 nM.In conclusion, the developed aptamer is a promising candidate for further characterization studies. These would include comprehensive testing of various type strains, environmental isolates, limit of detections and sample matrices. More importantly, the established bacterial whole cell-SELEX process provides a solid basis for developing aptamers against bacterial cells and can be used for a variety of health-relevant bacteria (e.g. indicator bacteria, pathogens and other bacterial populations).