BioSealing - isolation, identification and investigation of bacteria involved in the bioclogging process

Abstract

BioSealing bietet ein innovatives in-situ-Verfahren zum nachhaltigen Versiegeln von Leckagen und Spalten in Untergrundkonstruktionen durch eine Kombination mikrobiologischer sowie geochemischer Prozesse. Die Methode beruht auf natürlicher, im Boden vorkommender Bakterien, die durch Zugabe geeigneter Nährmedien in ihrer Vermehrung und Aktivität angeregt werden. Als Folge bildet sich ein natürlicher Bioschleim, der zu einer Reduzierung der Porosität des Bodens führt. Einer der Schwerpunkte der Arbeit waren jene Bakterien, welche extrazelluläre polymere Substanzen (EPS) - Grundlage des "Bioclogging" - produzieren. Isolierte Bakterien aus Erd- und Wasserproben zweier BioSealing-Pilotprojekte in Niederösterreich (Altenwörth und Greifenstein) wurden als physiologische Modelle zur Untersuchung der EPS-Produktion verwendet. Kartoffelrestfruchtwasserkonzentrat (PNC) und Restmelasse (RM) - zwei Nebenprodukte der Kartoffelstärke- bzw. Zuckerproduktion - dienten als potentielle Substrate zur EPS-Anregung. Zusätzliches Ziel dieser Arbeit war es, molekularbiologische, kultivierungsunabhängige Methoden zur Quantifizierung der Gesamtbakterienpopulation sowie dominanter Phyla zu evaluieren, um mikrobielle Überwachungsstrategien für zukünftige BioSealing-Anwendungen zu entwickeln. 16 S rRNA Gen-Sequenzen wurden nach erfolgter Kultivierung, DNA-Extraktion und PCR-Amplifikation zum spezifischen Nachweis der Isolate herangezogen. Die identifizierten Bakterienarten wurden mittels "Flocculating Activity (FA) Assay" auf ihre EPS-Produktion, begleitend von Biomasse-Monitoring, getestet. Isolierte und aufgereinigte EPS wurden im Rasterelektronenmikroskop auf deren Struktur untersucht. In einem weiteren Schritt wurde DNA direkt aus Umweltproben isoliert und für die Validierung einzelner qPCR-Assays mit taxonspezifischen Primerpaaren verwendet. Die gesamte Bakterienpopulation wurde zusätzlich durch Epifluoreszenzmikroskopie quantifiziert. Alle identifizierten Sequenzen waren typischen Süßwasser- sowie Erdbakterienstämmen zugehörig. Darunter zeigten zwei gram negative, aerob wachsende Isolate die höchsten FA. Aufgereinigte EPS unterschieden sich morphologisch signifikant je nach verwendetem Isolat sowie Medium. Es konnte nachgewiesen werden, dass PNC und RM als potentielle Substrate für weitere BioSealing-Projekte eingesetzt werden können. Direkte DNA Isolation aus Erdproben stellte einen kritischen Punkt dar. DNA-Ausbeute sowie Reinheit waren jeweils von der verwendeten Extraktionsmethode abhängig. Primerkombinationen, spezifisch für - und ß-Proteobacateria sowie Actinobacteria, ermöglichten eine zuverlässige Quantifizierung. Direkte fluoreszenzbasierte Gesamtzellzählungen aus Erdproben erforderten ausreichende Verdünnung sowie eine zusätzliche Ultraschallbehandlung, um eine unabhängige Quantifizierung der Gesamtbakterienpopulation zu ermöglichen.

BioSealing is an innovative in-situ method to seal leakages in subsurface caused by a combination of microbiological and geochemical processes. It is based on naturally occurring soil-bacteria, which are stimulated by the injection of nutrients causing clogging because of formation of bioslime near the leakage in order to reduce soil permeability. This study focuses on extracellular polymeric substances (EPS) producing bacteria, the basis for the bioclogging process. Soil and water samples from two BioSealing pilote projects in Lower Austria (Altenwörth and Greifenstein) were used to isolate bacteria, which represented physiological models for the EPS producing capability. For this purpose, two by-products of the starch and sugar production, potato nitrogen concentrate (PNC) and rest molasses (RM), were used as potential sustainable substrates for EPS production. Another goal of this study was to validate methods for quantification of total bacterial community and dominant bacterial phyla in order to develop microbial monitoring strategies for future BioSealing applications. Following cultivation, DNA extraction and PCR amplification, the sequenced 16S rRNA gene regions were used for specific detection of various isolates. The identified bacterial species were assessed for their EPS-producing capability by applying the 'Flocculating Activity (FA) Assay' together with biomass monitoring. EPS were partially purified and structurally analysed by a scanning electron microscope. In a second step, total environmental DNA was extracted and used for the validation of quantitative PCR (qPCR) with taxon-specific primer pairs. Moreover, fluorescence-based microscopic total cell counting was conducted. All sequences obtained were closely related to typical bacterial freshwater and soil phyla. Selecting promising EPS producing bacterial strains, two-gram negative, aerobic growing bacteria showed the highest FA. Partial purified EPS led to significant morphologic differences of the polymers among different media and isolates tested. It could be deduced that PNC and RM are promising substrates for BioSealing. The environmental DNA isolation process was shown to be a challenging task. DNA yields and purities depended on different extraction methods used. Taxon-specific qPCR assays specific to the phlya --and ß-Proteobacteria and Actinobacteria enabled reliable quantification. Total cell counting by epifluorescence microscopy using DAPI and PI dyes turned out to be strongly depended on the correct dilution and sonification step. However, it could provide an independent quantification of total bacterial population.