Zielgerichtete Mutagenese zur Identifizierung von Sequenzunterschieden zwischen Chalkon 3-hydroxylase und Flavonoid 3'-hydroxylase

Abstract

Chalkon 3-hydroxylase und Flavonoid 3'-hydroxylase sind Cytochrom P450 abhängige Monooxygenasen, die im B-Ring von Chalkonen und/oder verschiedenen Flavonoidklassen eine zusätzliche Hydroxylgruppe an der Position 4 (Chalkone) bzw. 4' (Flavonoide) zu der bereits vorhandenen OH-Gruppe einführen. Während die F3'H keinen Umsatz mit Chalkonen zeigen weist die CH3H eine breitere Substratakzeptanz auf, da sie sowohl Chalkone als auch Flavonoide umsetzt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden sieben cDNÄKlone aus Bidens ferulifolia, Cosmos sulphureus, Dahlia variabilis und Coreopsis grandiflora bearbeitet. Bei den drei erstgenannten Pflanzen waren Paare aus CH3H und F3'H vorhanden, während bei Coreopsis grandiflora nur eine Aminosäuresequenz unbekannter Substratspezifität vorlag. Fünf der sieben verfügbaren cDNA Klone lagen bereits in einem Plasmid vor, der einen C-terminalen Strep-Tag aus acht Aminosäuren enthielt. Die cDNA Klone CH3H aus D. variabilis sowie F3'H aus C. sulphureus mussten erst mit dem Strep-Tag versehen werden. Sequenzunterschiede zwischen den Proteinen wurden durch zielgerichtete Mutagenese auf ihren Einfluss auf die Substratakzeptanz bzw. -spezifität abezüglich Isoliquiritigenin, Apigenin Dihydrokämpferol, Kämpferol und Naringenin untersucht. Im Rahmen der Diplomarbeit wur- den bestimmte Positionen in den Aminosäuresequenzen als potenziell relevant für die Funktionalität der Enzyme identifiziert. Insbesondere die Modifikation an der Position 136 verursachte eine erhebliche Änderung der Aktivität bei drei der untersuchten Enzyme (C. sulphureus CH3H und F3'H sowie C. grandiflora). Wie aus der Untersuchung der Sequenzen hervorging, enthielten alle Enzyme mit Ausnahme des aus C. grandiflora isolierten an Stelle 136 Prolin während sich in letzterem ein Serin an der genannten Position befand. Durch diesen gezielten Austausch bei C. grandiflora konnte ein mit nur geringem Naringenin-Umsatz fast inaktives Enzym in ein funktionelles aktives Enzym umgewandelt werden. Der entgegengesetzte Austausch von Serin in Prolin an der Position 136 führte bei C. sulphureus CH3H und F3'H zu einem inaktiven Enzym. Andere untersuchte Positionen, die sich zum größten Teil in oder in der Nähe der verschiedenen Substraterkennungsstellen befinden, erwiesen sich als wenig einflussreich auf die Substratakzeptanz bzw. -spezifität.

Chalcone 3-hydroxylase (CH3H) and flavonoid 3'-hydroxylase (F3-H) are cytochrome P450 dependent monooxygenases. Chalcones and/or other flavonoidclasses carry an extra hydroxyl group at position 4 (chalcone) or 4' (flavonoid) to the already existing hydroxyl group in ring B. While F3'H shows no conversion of chalcones, CH3H accepts a broad range of substrates, and hydroxylates both chalcones and flavonoids. In this thesis, seven cDNA clones from Bidens ferulifolia, Cosmos sulphureus, Dahlia variabilis and Coreopsis grandiflora were studied. Pairs of CH3H and F3'H from the first three plant species and a single F3-H cDNA clone from C. grandiflora were available. From the seven cDNA clones, five were already present in the pIBA51 vector conveying the C-terminal strep-tag of eight amino acids. The other two cDNA clones encoding CH3H D. variabilis and F3'H C. sulphureus were subcloned into the the pIBA51 vector. Sequence differences between the translated proteins putatively determining substrate specificity were analyzed by site-directed mutagenesis. The substrate specificity of resulting recombinant mutated proteins were tested with the five (14C)-labelled substrates isoliquiritigenin, apigenin, dihydrokaempferol, kaempferol and naringenin. It could be shown that substrate specificity is not determined by single locations but must be a result of the interaction of several amino acids in the N-terminal regions. Position 136 in the C. grandiflora amino acid sequence was identified as potentially relevant for the functional activity of this enzyme type. A highly conserved serine is present in all CH3Hs and F3-Hs, whereas the C.grandiflora F3-H showed a proline in this position. This results in an inactive enzyme as shown by site-directed mutagenesis. In this work the importance of the serine in position 136 was confirmed by introducing the proline in the CH3H and F3-H of Cosmos sulphureus. This triggered the opposite effect and resulted in functionally inactive enzymes.