Development of novel approaches for the molecular detection of health-relevant bacteria in water

Abstract

The aim of this thesis was to provide a foundation for future rapid, simple and low-cost water quality test systems. To this end, two novel molecular assays based on isothermal helicase-dependent amplification (HDA) were developed that can be performed on a simple heating block: (i) an HDA assay for the detection Enterococcus spp. as marker for general faecal pollution and (ii) an HDA assay for the detection of ruminant faecal pollution in environmental waters. Their applicability as complementary qualitative screening tools was thoroughly evaluated and compared to existing quantitative PCR (qPCR)-based assays. Overall, HDA results were consistent with those of qPCR reference methods. Given their performance and their simplified reaction scheme, they can be used for developing rapid on-site molecular screening tools and can serve as amplification platforms in microfluidic lab-on-a-chip systems. Furthermore, a development platform for novel molecular recognition molecules, so called DNA aptamers was established. These functional nucleic acids, also known as synthetic or chemical antibodies, bind to molecular targets on the cell-surface of bacteria with high affinity and specificity. In contrast to their antibody counterparts, they are generated by an in vitro selection process termed cell-SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Using a new and combined approach based on cell-SELEX, state-of-the art qPCR analyses, next-generation sequencing and bioinformatic data analyses, a total of 16 aptamer candidates were identified for E. faecalis, which served as a model organism to establish the platform. These inexpensive binding ligands could be used for different direct cell detection methods, such as flow cytometry, fluorescence microscopy or biosensor development. Overall, the developed SELEX platform provides a solid foundation to rapidly and efficiently generate aptamer binding ligands. Through minor modifications, it can be used for a variety of health-relevant bacteria in water, including pathogens, indicator bacteria other bacterial populations.

Ziel dieser Arbeit war es, eine Grundlage für zukünftig schnelle, einfache und kostengünstige Testsysteme für die Wasserqualitätsüberprüfung zu schaffen. Hierfür wurden zwei neue molekulare Verfahren entwickelt, die auf isothermalen Helikase-abhängigen Amplifikation (HDA) basieren und auf einem einfachen Heizblock durchgeführt werden können: (i) ein HDA Assay zum Nachweis von Enterokokken als Marker für Gesamtfäkalbelastungen sowie (ii) ein HDA Assay zum Nachweis von Fäkaleinträgen durch Wiederkäuer in Umweltgewässer. Ihre Anwendbarkeit als komplementäre qualitative Screening-Verfahren wurde gründlich evaluiert und mit bestehenden quantitativen PCR (qPCR)-basierten Verfahren verglichen. Insgesamt stimmten die HDA-Ergebnisse mit denen der qPCR-Referenzmethoden überein. Aufgrund ihrer Leistung und ihres vereinfachten Reaktionsschemas können sie zur Entwicklung von schnellen und vor-Ort einsetzbaren molekularen Screening-Methoden verwendet werden und als Amplifikationsplattformen in mikrofluidischen Lab-on-a-Chip-Systemen dienen. Darüber hinaus wurde eine Entwicklungsplattform für neuartige molekulare Erkennungsmoleküle, sogenannte DNA-Aptamere, etabliert. Diese funktionellen Nukleinsäuren, auch als synthetische oder chemische Antikörper bekannt, binden mit hoher Affinität und Spezifität an Zelloberflächenstrukturen von Bakterien. Im Gegensatz zu Antikörpern werden sie durch einen In-vitro-Selektionsprozess erzeugt, der als Zell-SELEX (Systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) bezeichnet wird. Unter Verwendung eines neuen kombinierten Ansatzes basierend auf Zell-SELEX, modernsten Anwendungen von qPCR, Next-Generation-Sequencing und bioinformatischer Datenanalyse konnten insgesamt 16 Aptamer-Kandidaten für E. faecalis identifiziert, der als Modellorganismus für die Etablierung der Plattform diente. Diese kostengünstigen Bindungsliganden könnten für verschiedene Direktzellnachweisverfahren nützlich sein, wie beispielsweise Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie oder Biosensorentwicklung. Insgesamt bietet die entwickelte SELEX-Plattform eine solide Grundlage für die schnelle und effiziente Erzeugung von Aptamer-Bindungsliganden. Durch geringfügige Modifikationen kann sie für eine Vielzahl von gesundheitsrelevanten Bakterien im Wasser verwendet werden, einschließlich Krankheitserregern, Indikatorbakterien und anderen Bakterienpopulationen.