Metagenomic study of the microbial community associated with nests, leaves and ant specimens of Borneo’s ‘exploding ants’

Abstract

Die so genannten “Explodierenden Ameisen” gehören dem Spezienkomplex Colobopsis cylindrica (COCY) an und sind für vergrößerte Mandibeldrüsen sowie für die Ausscheidung von Drüsensubstanzen in territorialen Kämpfen bekannt. Im Umkreis des Forschungsstandorts des Projekts „Voluntary self-sacrifce in Borneo’s exploding ants: A mechanism to defend co-evolved microbiomes?“, dem tropischen Tiefland-Regenwald rund um das Kuala Belalong Field Studies Centre (KBFSC) in Brunei Darussalam, sind mindestens 15 Spezies der „Explodierenden Ameisen“ bekannt, welche potentiell neu für die Wissenschaft sind und rund 70% aller Ameisen in diesem Gebiet ausmachen. Im Ökosystem Regenwald sind Ameisen die dominanten Gliederfüßer und spielen eine wichtige Rolle in der Umverteilung der Nährstoffe . Hypothesen besagen, dass das suizidale Verhalten der explodierenden Ameisen ihre Fraßplätze vor Kontaminationen durch Mikroben anderer Ameisen verteidigen soll, da das Mikrobiom von essentieller Bedeutung im Hinblick auf Ökologie, Ernährung und für potentielle Symbiosen ist. Die vorliegende Studie zeigt erste Einblicke in das bakterielle Mikrobiom der kürzlich charakterisierten Spezies Colobopsis explodens sowie einer verwandten Spezies mit dem Nicknamen „BBQ“ (Colobopsis sp. „BBQ“, im weiteren Verlauf BBQ). Mithilfe von Next Generation Sequencing basierend auf der Amplifizierung und Sequenzierung des bakteriellen 16S rRNA Gens mittels Illumina Technologie wurden Ameisennester, Blattepiphyten und die Ameisen selbst untersucht. Außerdem umfasst sie die Optimierung der Probenvorbereitung, DNA-Extraktion und der Herstellung der DNA-Bibliothek für unterschiedliche Probentypen. Die verwendeten Methoden, speziell die DNA-Extraktion, mussten so ausgewählt werden, dass das Gleichgewicht zwischen Quantität und Qualität gewährleistet ist, aber aber auch spezifisch für Bakterien sein, was mithilfe eines „Community Profilings“ durch die Amplifizierung und Analyse des bakteriellen IGS (intergenic spacer) und die Trennung der unterschiedlichen PCR-Produkte am Fragment Analyzer überprüft wurde. Die unterschiedlichen bioinformatischen Pipelines, die in dieser Studie getestet wurden, zeigen, dass das Mikrobiom stark von der gewählten Prozessierung der Rohdaten und der Referenzdatenbank abhängig ist. Unsere Ergebnisse für das Mikrobiom von C. explodens und BBQ Ameisen geben Hinweise darauf, dass einige Bakterien in Verbindung mit der Ernährung oder dem Ernährungsverhalten der Ameisen stehen. Die Gattung Alishewanella wurde bisher noch nicht mit Ameisen in Verbindung gebracht, aber in dieser Studie folgt diese demselben Muster wie Ca.Blochmannia, eine Gattung die bereits als Endosymbiont in Colobopsis Ameisen bekannt ist und eine Rolle in der Aminosäurensynthese spielt. Daher lautet die Hypothese, dass Alishewanella eine essentielle Rolle im Verdauungstrakt der explodierenden Ameisen spielt. Weiters könnten die Gattung Serratia, die als Endosymbiont in Blattläusen bekannt ist, und Bakterien der Ordnung der Entomoplasmatales, die mit verschiedenen Insekten in Verbindung gebracht werden, über kontaminierte Nahrungsquellen mit der Ernährung der Ameisen in Verbindung stehen. Stickstoff-fixierende Nest-Bakterien von C. explodens könnten insofern eine Rolle spielen, als dass sie die Ameisen mit Stickstoff-reichen Nährstoffen versorgen. Andere Bakterien wie Lactococcus, Burkholderia und Actinobakterien könnten durch ihr Potential antimikrobielle Substanzen zu produzieren Pflanzen vor Pathogenen schützen oder eine Rolle in der Nesthygiene der Ameisen spielen. Acinetobacter war in der gesamten Probenauswahl stark vertreten, aber auch Pseudomonas wurde häufig detektiert. Diese Gattungen, aber auch Staphylococccus, eine Gattung die hauptsächlich außerhalb der Nester und als Blattepiphyt detektiert wurde, scheinen der Umwelt zu entspringen. Zusammenfassend bereitet das Mikrobiom der explodierenden Ameisen einen Einblick in verschiedene Funktionen der Ameisen im Ökosystem Regenwald und bietet interessante Anhaltspunkte für weitere Forschung.

The species complex Colobopsis cylindria (COCY) includes the so called “Exploding ants” which are known for hypertrophy of mandibular glands (MG) and for its release of glandular products in territorial combat. From the study site of the project “Voluntary self-sacrifce in Borneo’s exploding ants: A mechanism to defend co-evolved microbiomes?”, the lowland tropical rainforest around the Kuala Belalong Field Studies Centre (KBFSC) in Brunei Darussalam, Borneo, at least 15 species of exploding ants, probably new to science, are known and make up almost 70% of all ants there. In the rainforest ecosystem ants play an important role in the redistribution of nutrients and are the dominant arthropods there. It is claimed that the suicidal behaviour of exploding ants protects foraging grounds from foreign microbes introduced by other ants as the microbiome may be essential for them by the means of ecology, nutrition and in potential symbiosis. This study provides the first insight into the bacterial microbiome of nests, leaf epiphytes and ants themselves of the recently described species Colobopsis explodens[6] and a closely related species nicknamed “BBQ” (Colobopsis sp. “BBQ”, further referred to as BBQ) on the level of Next Generation Sequencing based on the amplification and sequencing of bacterial 16S rRNA gene using Illumina Technology. It also includes the optimization of sample preparation, DNA extraction and library preparation for different sample types. The applied methods, especially the DNA-extraction, had to be chosen in a way which allowed a balance between quantity and quality, but also to be target-specific to bacteria, which was examined by a community fingerprinting via bacterial ribosomal intergenic spacer analysis and a separation of resulting PCR-products via fragment analyzer. Different bioinformatic pipelines tested in this study showed that the microbiome community is strongly dependent on the processing of the raw data and the used reference database. Our results of the microbiome of C. explodens and BBQ ants revealed evidence of some bacteria being in connection to the ants’ nutrition or nutritional behaviour. The bacterial genus Alishewanella has not been associated with ants so far, however in this study this genus follows the same pattern as Ca.Blochmannia does, an already known Colobopsis ant endosymbiont which is involved in amino acid synthesis, with significantly higher abundance than Ca.Blochmannia. It is hypothesized that Alishewanella may play an essential role in Colobopsis ants’ gut microbiome. Furthermore Serratia, a known endosymbiont of aphids, and Entomoplasmatales which occur in diverse interactions with various insects may be associated to ants’ nutrition through food sources which may carry this bacteria. Nitrogen-fixing nest bacteria detected in carton structure of C. explodens nests may also play a role in the nutrition of ants, providing nitrogen-rich nutrients. Other bacteria like Lactococcus, Burkholderia and Actinobacteria may be involved in the protection of plants from pathogens or in nest hygiene through the production of antimicrobial substances. Acinetobacter was highly abundant in the whole sample set, but also Pseudomonas has been detected in many samples. These genera are hypothesized to be environmental bacteria originating from the surrounding environment like Staphylococcus which was detected mainly outside the nests and on leaves. Summing up the microbiome of these ants provides an insight into various functions of ants in the rainforest ecosystem and directs further research.