Development of a rapid methanogenic DNA extraction method from biogas digesters

Abstract

Die Biogasproduktion ist einer der Schlüsseltechnologien der erneuerbaren Energien. Die Zahl der Biogasanlagen in Deutschland steigt stetig um das angestrebte Ziel der Energiewende zu erreichen. Um möglichst große Biogasausbeuten erzielen zu können, bedarf es einer Vielzahl verschiedener Methanbildnern. Durch Extraktion von DNA und RNA aus Biogasproben kann ein direkter Rückschluss auf Änderungen in der Archaeen Population und deren Aktivität geschlossen werden. Um eine möglichst hohe Bandbreite an möglichen Substraten abzudecken wurden verschiedene Biogasanlagen welche mit z.B. Schlachtabfällen, Grassilage, Maissilage, Gülle oder Ganzpflanzensilage beschickt werden, beprobt. Als Referenz wurde Abwasser aus einer Kläranlage verwendet. Anfangs wurde mit dem Testen verschiedener aus der Literatur beschriebener manueller und Kit basierten DNA Extraktionsmethoden für Böden, Schlämme und Biogasanlagen begonnen. Zudem wurden verschiedene Vorbehandlungen der einzelnen Proben evaluiert. Eine manuelle Extraktionsmethode nach Griffiths et al. und ein modifizierter Power Soil Kit der Firma MoBio zeigten die besten Resultate. Beide basieren auf Lyse der Archaeen durch Zugabe von SDS und einer starken mechanischen Beanspruchung in einem Bead-beater. Die erhaltene DNA konnte direkt ohne zusätzlichen Reinigungsschritt für die PCR Analysen eingesetzt werden.<br />Das Vorhandensein von Archaeen-DNA wurde auf verschiedenen taxonomischen Ebenen mittels spezifischer Primer, welche Gene für die Methyl-Coenzyme M Reduktase und 16S rRNA amplifizieren, getestet. Die Spezifität der Primerpaare wurde mittels Amplifizieren gezüchteter Reinkulturen sichergestellt. Um einen groben Überblick über die enthaltenen Methanbildner zu bekommen wurden mittels der Reinkulturen DGGE Analysen durchgeführt um später einen DGGE Standard etablieren zu können. Die erhaltenen Ergebnisse wurden mittels einer 454 Pyro-Sequenzierung überprüft. Zuletzt wurden Vorversuche zur Entwicklung einer qPCR gemacht, um die erhaltene DNA quantifizieren zu können. Da die manuelle Extraktion bei den Reinkulturen keine PCR Produkte lieferte, konnte kein vernünftiger Standard für alle Stämme entwickelt werden.<br />In dieser Arbeit wurden zwei Methoden zur Extraktion der DNA von Methanbildnern aus Biogasreaktoren mit höchst unterschiedlichen Substraten entwickelt und verbessert. Durch die Bestimmung der Populationszusammensetzung mittels PCR ist eine Aussage über den biologischen Zustand der Anlage innerhalb von Stunden nach Probenahme möglich. Dadurch ergibt sich ein klarer finanzieller und zeitlicher Vorteil gegenüber der bisher verwendeten indirekten Messung von Indikatorsubstanzen.<br />

Biogas production is one of the key technologies to reach the energy turnaround using renewable energies. Therefore, in Germany the number of biogas plants is increasing every year. To reach a high biogas yield a various number of methanogenic species have to be present during the process.<br />The composition of the Methanogen population and their activity can be detected with DNA and RNA retrieved from the biogas samples. To represent a wide range of possible substrates, samples from different mesophilic biogas plants, using slaughterhouse waste, grass and maize silage or semiliquid manure as substrates, were taken. As reference a sample from a wastewater treatment plant was used.<br />Initially different in literature described manually and kit based extraction methods and the appropriated pretreatments were tested. A manual based extraction method by Griffiths et al. and a modified MoBio Power Soil Kit worked best for extraction of Archaea-specific DNA. The two methods are basing on cell lysis with SDS and strong mechanical stress in a beat-beater. No additionally purification step was needed.<br />The presence of Methanogens was proved on different taxonomical levels with specific primers targeting on the MCR A and 16S rRNA genes. The specificity was demonstrated by amplification of Archaea pure cultures.<br />To give a general overview of the Methanogen population a DGGE with the pure strains was performed to develop a DGGE standard in future work.<br />All results were checked with a 454 pyrosequencing.<br />Finally pretests for development of a qPCR method for quantification of the DNA were done. Due to the reason that the manual extraction give no PCR signal with the pure cultures it was not possible to establish a qPCR standard for all strains.<br />In this work two methods extraction of methanogenic DNA from a wide range of different biogas substrates and matrixes were developed and improved. By the determination of population composition with the PCR technique an evaluation of the biological state of the digestion process within some hours is possible. This means a time and cost saving in compare to the measurement of indirect indicators.