Development of a filamentous fungi cultivation process in bioreactor for erythritol production

Abstract

Erythritol is a sugar alcohol that serves as a metabolite or storage substance in nature and is found in various fruits, mushrooms or seaweed. With increasing sugar consumption, erythritol is becoming more attractive, especially in its ability as a sweetener. Its near-zero calories and the fact that erythritol, unlike other sweeteners, does not cause changes in blood glucose levels or gastrointestinal problems make erythritol one of the most promising and safest candidates for sugar replacement. Currently, erythritol is produced mainly in genetically modified osmophilic yeasts, such as Torula sp. or Candida magnoliae. However, due to widespread skepticism and strict European regulations towards GMOs, a promising approach would be to produce in wild types. A potential production organism is the ascomycete Trichoderma reesei. In the course of the wholeproject, the production of erythritol by a wild type of T. reesei will be investigated and a process for this should be developed. This thesis follows up on experiments performed in shake flasks. The aim is to establish a process for erythritol production by T. reesei in bench-scale bioreactors. For this purpose, the influence of stirring and aeration, fermentation time, batch and discontinuous fed-batch operation modes, and reactor volume on erythritol production in bioreactors was investigated. In addition, further studies were carried out in shake flasks to assess the influence of media components such as Tween80, peptone or antifoam on product formation. A Design of Experiments (DoE) was also conducted to determine the effect of temperature and initial pH on the process. However, foam formation and uncontrolled growth in bioreactors led to a premature end of the fermentation after 96 hours of cultivation. This shortened cultivation time was the faced challenge with a significant impact on erythritol formation. Foam formation was reduced/controlled by the addition of antifoam. Nevertheless, only yields of a maximum of 17,29 mg erythritol per gram of biomass formed and 11,02 mg erythritol per gram of glucose consumed could be achieved, which was significantly below the yields obtained in shake flasks. For comparison, in shake flasks, yields of 15,27 mg of erythritol per gram of glucose and 80,06 mg of erythritol per gram of biomass could be realized. However, insights were gained on the impact of certain parameters and it opens the path to ideas to test for an improvement of the process. A Design of Experiments showed that initial pH and temperature correlate with each other and significantly influence erythritol production, indicating that it has not yet been performed at the optimum of these two parameters. Moreover, knowledge was gained about the influence of stirring and aeration and the operation mode. Based on these experiences, further process development should be carried out.

Erythritol ist ein Zuckeralkohol, der in der Natur als Stoffwechselprodukt oder Speicherstoff dient und in verschiedenen Früchten, Pilzen oder Algen vorkommt. Mit zunehmendem Zuckerkonsum gewinnt Erythritol an Attraktivität, insbesondere als Süßungsmittel. Die Tatsache, dass Erythritol nahezu keine Kalorien enthält und im Gegensatz zu anderen Süßungsmitteln keine Veränderungen des Blutzuckerspiegels oder Magen-Darm-Probleme verursacht, macht Erythritol zu einem der vielversprechendsten und sichersten Kandidaten für Zuckerersatz. Derzeit wird Erythritol hauptsächlich in gentechnisch veränderten osmophilen Hefen wie Torula sp. oder Candida magnoliae hergestellt. Aufgrund der weit verbreiteten Skepsis und der strengen europäischen Vorschriften gegenüber GVOs wäre ein vielversprechender Ansatz die Produktion in Wildtypen. Ein möglicher Produktionsorganismus ist der Ascomycet Trichoderma reesei. Im Verlauf des gesamten Projekts soll die Produktion von Erythritol durch einen Wildtyp von T. reesei untersucht und ein Verfahren dafür entwickelt werden. Diese Arbeit knüpft an Experimente an, die in Schüttelkolben durchgeführt wurden. Ziel ist die Etablierung eines Verfahrens zur Erythritolproduktion durch T. reesei in Bioreaktoren im Labormaßstab. Zu diesem Zweck wurde der Einfluss von Rühren und Belüften, Fermentationszeit, den Fermentationsmodi Batch- und diskontinuierlicher Fed-Batch sowie des Reaktorvolumens auf die Erythritolproduktion in Bioreaktoren untersucht. Darüber hinaus wurden weitere Untersuchungen in Schüttelkolben durchgeführt, um den Einfluss von Medienkomponenten wie Tween80, Pepton oder Antischaummittel auf die Produktbildung zu bewerten. Außerdem wurde ein Design of Experiments (DoE) ausgeführt, um die Auswirkungen von Temperatur und initialen pH-Wert auf den Prozess zu ermitteln. Schaumbildung und unkontrolliertes Wachstum in den Bioreaktoren führten jedoch zu einem vorzeitigen Ende der Fermentation nach 96 Stunden Kultivierungszeit. Diese verkürzte Kultivierungszeit war eine Herausforderung mit großem Einfluss auf die Erythritolbildung. Die Schaumbildung konnte durch Zugabe von Antischaum reduziert/kontrolliert werden. Dennoch konnten nur Erträge von maximal 17,29 mg Erythritol pro Gramm gebildeter Biomasse und 11,02 mg Erythritol pro Gramm verbrauchter Glukose erzielt werden, was deutlich unter den in Schüttelkolben erzielten Erträgen lag. Zum Vergleich: In Schüttelkolben konnten Ausbeuten von 15,27 mg Erythritol pro Gramm Glukose und 80,06 mg Erythritol pro Gramm Biomasse erzielt werden. Es wurden jedoch Erkenntnisse über die Auswirkungen bestimmter Parameter gewonnen, die neue Wege für eine Prozessverbesserung eröffnen. Das Design of Experiments zeigte, dass der initiale pH-Wert und die Temperatur miteinander korrelieren und die Erythritolproduktion erheblich beeinflussen unddeutet darauf hin, dass das Optimum dieser beiden Parameter noch nicht erreicht wurde. Darüber hinaus wurden Erkenntnisse über den Einfluss von Rühren und Belüften sowie der Fermentationsmodi gewonnen. Auf der Grundlage dieser Erfahrungen sollte weitere Prozessentwicklung durchgeführt werden.