Chemical spectroscopy of individual human milk extracellular vesicles

Abstract

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind nanoskalige Partikel, die mit verschiedenen physiologischen und pathologischen Funktionen in Verbindung gebracht werden. Sie spielen eine Schlüsselrolle bei der Kommunikation zwischen den Zellen und werden als Transportmittel für verschiedene Zellbestandteile verwendet. Es wird angenommen, dass EVs in der menschlichen Milch wichtig für die Ernährung von Säuglingen und für die Entwicklung ihrer erworbenen Immunität sind. Moderne Analysemethoden sind nicht in der Lage, markierungsfreie chemische Informationen auf der Ebene einzelner Vesikel zu liefern. Daher sind neue Analysetechniken erforderlich, um die chemischen Unterschiede innerhalb der EV-(Sub-)Population zu untersuchen [1]. Wir stellen ein Protokoll zur Erstellung von Profilen der Struktur und Zusammensetzung einzelner EVs mit Hilfe der photothermischen Rastersonden-Infrarotspektroskopie (AFM-IR) vor. Zunächst werden EVs mit Hilfe vonmikrokontaktgedruckten Anti-CD9-Antikörpern auf einer Silikonoberfläche immobilisiert. AFM-IR liefert dann sowohl die EV-Größe als auch Spektren im mittleren Infrarotbereich für einzelne Vesikel. Die erhaltenen Spektren lassen sich gut mit Bulk-Referenzspektren vergleichen. Darüber hinaus liefern AFM-IR-Bilder spektrale Informationen für mehrere EVs innerhalb einer einzigen Messung. Das Stapeln von Bildern, die bei unterschiedlichen Wellenzahlen aufgenommen wurden, liefert hyperspektrale chemische Bilder von Vesikelnmit räumlicher Auflösung im Nanobereich.

Extracellular vesicles (EVs) are nanosized particles, which are associated with various physiological and pathological functions. They play a key role in intercell communication and are used as transport vehicles for various cell components. In human milk, EVs are believed to be important for the nutrition of infants and for the development of their acquired immunity. State of the art analysis methods are not able to provide label free chemical information at the single-vesicle level, hence new analysis techniques are required to study the chemical difference within EV (sub-)population [1]. We introduce a protocol to profile structure and composition of individual EVs with the help of photothermal scanning probe infrared spectroscopy (AFM-IR). First, EVs are immobilized onto a silicone surface using microcontact printed Anti-CD9 antibodies.AFM-IR then provides both EV size and mid-infrared spectra for individual vesicles. The received spectra compare favorably to bulk reference spectra. In addition, AFM-IR images provide spectral information for multiple EVs within a single measurement. Stacking images taken at different wavenumbers yields hyperspectral chemical images of vesicles at nanoscale spatial resolution.