Nanoscale viscoelasticity of hydrated native collagen fibrils: The effect of chemically-induced non-enzymatic glycation and tendon type

Abstract

Sehnen sind komplexe, multihierarchische biologische Gewebe, deren verschiedene Sublevel unterschiedlich auf mechanische Belastung reagieren. Das kleinste Strukturelement sind Kollagenfibrillen, welche bereits erfolgreich mit Rasterkraftmikroskopie untersucht wurden. In bestehender Literatur werden Kollagenfibrillen mit Hilfe von Indentationsexperimenten im Mikro- oder Nanobereich charakterisiert, allerdings werden sie dabei meist als linear elastisch angenommen, während sie in Realität viskoelastisches Verhalten aufweisen. Um die viskoelastischen Materialkenngrößen (Phasenverschiebung zwischen Kraft und Indentation,dem Verlust-Tangens, dem Speicher- und dem Verlustmodul) zu bestimmen, wurde in dieser Masterarbeit ein Testprotokoll für frequenzabhängige Indentationsexperimente erarbeitet und eine Datenanalyse auf Grundlage der frequenzabhängigen Oliver-Pharr-Gleichungen programmiert. In einem ersten Experiment wurden Kollagenfibrillen von oberflächlicher Beugesehne und Strecksehne eines jungen und eines alten Pferdes (3 vs. 18 Jahre alt) getestet und miteinander verglichen. Das Messprotokoll bestand zunächst aus den vier Frequenzen10, 1, 0,5 und 0,1 Hz, und wurde im zweiten Experiment zu 10, 5, 1 und 0,5 Hz geändert, da die Daten aufgrund von Störfaktoren bei 0,1 Hz oftmals nicht mit einem Sinus approximiert werden konnten und die Experimentdauer stark verlängerten. Die Ergebnisse lassen sich bloß vorsichtig formulieren, da aufgrund wenig vorhandener, brauchbarer Daten, keine statistische Analyse durchgeführt wurde: Phasenverschiebungen zwischen Kraft und Indentation um ein paar Grad deuten auf ein viskoelatisches Materialverhalten hin, auch wenn kleine Verlustmodul-Werte im Vergleich zu Speichermodul-Werten auf ein generell recht elastisches Materialverhalten weisen.In einem zweiten Experiment sollte die These untersucht werden, dass im Alter nicht enzymatische, durch Glykierung entstehende Cross-links zwischen Kollagenmolekülen zunehmen und zu einer Änderung der mechanischen Eigenschaften führen. Dazu wurden die Kollagenfibrillen beider Sehnentypen des jungen Pferdes (3 Jahre alt) einem Glykierungsprozess mit Methylglyoxal (MGO) ausgesetzt. Mit MGO behandelte Kollagenfibrillen beider Sehnentypen weisen höhere Eindrucksmodul Werte auf, d.h. sind steifer als unbehandelte Fibrillen, unabhängig vom Alter. Dynamische Indentation ist eine in der Literatur aufgrund ihrer Aufwendigkeit bisher wenig verwendete Methode zur Charakterisierung von Kollagenfibrillen, jedoch deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass diese Methode Potential hat, den (viskoelastischen) Charakter von Kollagenfibrillen besser zu bestimmen. Weitere Tests mit modifiziertem Messprotokoll sollten durchgeführt werden. Der entwickelte MATLAB-Code zur Analyse der Daten kann als guter Grundstein für weitere Forschung dienen.

Tendons are complex, multi-hierarchical biological tissues whose different sub-levels react differently to mechanical stimulus. Their smallest structural elements are collagen fibrils, which have already been successfully examined using atomic force microscopy. In the existing literature, collagen fibrils are characterized by indentation experiments in the micro or nano range. However, they are most of the time assumed to be linearly elastic, while in fact they show viscoelastic behaviour. In order to determine the viscoelastic material parameters (phase shift between force and indentation, the loss tangent, the storage and the loss modulus), a test protocol for frequency-dependent indentation experiments was developed and a data analysis based on the frequency-dependent Oliver-Pharr equations was programmed. In a first experiment, collagen fibrils from the superficial digital flexor (SDFT) and common digital extensor (CDET) tendons of a young and an old horse (3 vs. 18 years old) weretested and compared. The measurement protocol initially consisted of four frequencies 10,1, 0.5 and 0.1 Hz and was changed to 10, 5, 1 and 0.5 Hz in the second experiment, since the data at 0.1 Hz could often not be approximated by a sine and extended the duration of the test considerably. The results can only be formulated cautiously, since no statistical evaluation was carried out due to a lack of usable data: Phase shifts between force and indentation by a few degrees indicate viscoelastic material behaviour, even if loss modulus values are small compared to storage modulus values, which indicate an overall quite elastic material behaviour. In a second experiment, the assumption was to be investigated that non-enzymatic crosslinking between collagen fibrils through glycation increases with age and leads to a change in mechanical properties. For this purpose, the collagen fibrils of both tendon types of the young horse (3 years old) were exposed to a glycation process with methylglyoxal (MGO). Collagen fibrils of both tendon types treated with MGO exhibit higher indentation modulus values, i.e. are stiffer than untreated fibrils, independent of age. Dynamic indentation is a method for characterizing collagen fibrils that has been little discussed in literature due to its complexity. However, the results of this work indicate that this method has the potential to better determine the (viscoelastic) character of collagenfibrils. Further tests with a modified measurement protocol should be carried out. The developed MATLAB code for analyzing the data in this thesis can serve as a good foundation for further research.