Trichoderma reesei as a source of novel bioactive compounds – Exploration of three biosynthetic gene clusters and design of a CRISPR/dCas9-based transcriptional activation tool

Abstract

Filamentöse Pilze produzieren eine Vielzahl bioaktiver Sekundärmetabolite. Die für diese Metabolite kodierenden biosynthetischen Gencluster sind jedoch unter Standardlaborbedingungen meist inaktiv. Die gezielte Aktivierung neuer Cluster stellt einen vielversprechenden Ansatz in der Entwicklung neuer Medikamente, dem Besiegen von mikrobiellen Resistenzen und in der biologischen Schädlingsbekämpfung dar.Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurden drei Gencluster des industriell relevanten Stammes Trichoderma reesei untersucht. Für die Produkte dieser drei aktivierten Cluster konnte Bioaktivität beobachtet werden. Die Produkte aller drei Cluster zeigten einen wachstumshemmenden Effekt auf die Pilze Alternaria alternata, Botrytis cinera, Fusarium oxysporum, und Rhizoctonia solani. Weiters zeigten die Produkte von Cluster 78 einen starken antibakteriellen Effekt gegen Escherichia coli. Für Cluster 78 wurde Diaportinsäure als UV-aktives Hauptprodukte identifiziert.Durch Co-Expressionsanalysen wurde ein erster Eindruck erlangt, welche Gene Teil dieser Cluster zu sein scheinen. Beobachtet wurde die Co-Regulation vieler vorhergesagter modifizierender Enzyme. Durch die Detektion von negativen Feedback-Schleifen in den Clustern 22 und 78 wurde ein besserer Einblick in die Regulation dieser Cluster erlangt. In einer Publikation einer anderen Arbeitsgruppe wurde Cluster 21 als der Ilicicolin H codierende trili-Cluster identifiziert. In dieser Publikation wurde die Epimerase triliE nicht als Teil des vorgeschlagenen Biosynthesewegs berücksichtigt. Hier konnte jedoch die Co-Regulation von triliE beobachet werden. Des Weiteren wurde ein co-regulierter, bisher unbekannter, potentieller RiPP-Cluster in Cluster 21 entdeckt.In einem zweiten Projekt wurde ein CRISPR/dCas-basiertes System zur schnellen, effizienten und spezifischen transkriptionellen Aktivierung von biosynthetischen Genclustern in T. reesei designt. Obwohl die Entwicklung von CRISPR/Cas-Systemen die Möglichkeiten der Sequenz-spezifischen DNA-Interaktion revolutionierte, stehen bis heute nur sehr wenige CRISPR/dCas Systeme für die Cluster-Aktivierung in filamentösen Pilzen zur Verfügung. Die Hauptkomponenten des hier designten Systems – ein dCas9-VPR enthaltender Stamm und sgRNA-Kassetten – wurden entwickelt und können eingesetzt werden, um die Funktionalität dieses Systems zu testen.

Filamentous fungi are a valuable source of bioactive secondary metabolites. However, biosynthetic gene clusters encoding those secondary metabolites often remain silent under standard laboratory conditions. Targeted transcriptional activation of silent clusters poses a promising approach in developing new drugs, battling microbial resistances, and finding novel biocontrol agents.Within this thesis, three biosynthetic gene clusters of the industrial working horse Trichoderma reesei were explored. For all three activated clusters, antifungal properties of cluster products against Alternaria alternata, Botrytis cinera, Fusarium oxysporum, and Rhizoctonia solani were observed. The products of cluster 78 further displayed a strong growth-inhibiting effect on Escherichia coli. For cluster 78, diaportinic acid was identified as the UV-active main product.Co-expression analysis gave a first idea of which genes are likely to be part of the clusters. Co-regulation was observed for multiple predicted tailoring enzymes. The detection of negative feedback loops upon deletion of the core biosynthetic genes in clusters 22 and 78 provided more insight into how these clusters are regulated. For cluster 21 no negative feedback regulation was detected. In previous literature cluster 21 was identified as the ilicicolin H encoding trili cluster. The TIM-like epimerase triliE was left out of the proposed pathway. However, within this thesis co-regulation of triliE was observed. Furthermore, a co-regulated potential novel RiPP cluster was discovered in cluster 21.In addition to this, the first CRISPR/dCas9-based transcriptional activation tool for T. reesei was designed. Although the development of CRISPR/Cas systems has revolutionized sequence-specific DNA interference, only very few CRISPR/dCas systems have been developed for the activation of biosynthetic gene clusters so far. The tool designed within this thesis aims to allow for easy, efficient, and highly specific transcriptional activation of clusters in T. reesei. By establishing the main components of this novel system – a dCas9-VPR containing strain and sgRNA cassettes – the groundwork for its proof-of-concept and application was laid.